2011 год № 2

Резюме:

Ключевые слова:

Summary:

Key words:

Введение

Лишайник рода Cladonia давно применяется в традиционной медицине. Известны его антиоксидантные, антимикробные и детоксикационные свойства. В состав Cladonia входит широкий спектр соединений, таких как амино-β-полисахариды, усниновые, орселиновые, леканоровые, гирофоровые и хиастовые кислоты, гидроксинафторхиноны и гидроксиантрахиноновые и другие ароматические пигменты, депсидоны, антранорины, полиненасыщенные жирные кислоты и т.д. [1]. В данной работе нами была изучена способность водно-спиртового экстракта слоевищ лишайника рода Cladonia, предварительно обработанных диоксидом углерода в состоянии сверхкритической жидкости - препарат "Ягель" [2],

улучшать инсулин-секреторную функцию β-клеток поджелудочной железы.

С этой целью была проведена инкубация β-клеток с препаратом "Ягель" в течение 1, 2, 7, 14, 21 и 30 дн. В каждый из указанных периодов проводилось измерение глюкозостимулированной секреции инсулина. Было обнаружено, что на 21-30 дн. инкубации β-клеток с препаратом "Ягель" происходило увеличение чувствительности β-клеток к глюкозе, что сопровождалось секрецией большего количества инсулина по сравнению с β-клетками, инкубированными без препарата. Увеличение секреции инсулина β-клетками коррелировало с повышением митохондриальной продукции АТФ. Полученные результаты позволяют рекомендовать препарат "Ягель" в качестве дополнительного средства для нормализации уровня глюкозы у пациентов с сахарным диабетом второго типа (СД2).

Материалы и методы

β-клетки линии INS-1 (клон 832/13) культивировались в инкубаторе при 37°С во влажной атмосфере воздуха 95% и с концентрацией СО₂ 5%, в среде RPMI1640. Среда RPMI1640 содержала 11,1 мМ D-глюкозы, 10% эмбриональной сыворотки теленка, 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 10 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 10 мМ HEPES и 50 мкМ β-меркаптоэтанола [3]. При достижении плотности 80-90% β-клетки трипсинизировались смесью 0,1% трипсина и 0,02% EDTA и затем высеивались в 24-луночные планшеты за 48 ч до проведения эксперимента. Для измерения секреции инсулина клетки в течение 2 ч инкубировались в буфере, содержащем 114 мМ NaCl; 4,7 мМ КСI; 1,2 мМ КН₂РО₄; 1,16 мМ MgSO₄; 20 мМ HEPES; 2,5 мМ СаСI₂; 25,5 мМ NaHCO₃; 0,2% бычьего сывороточного альбумина; рН 7,2 и 2,8 мМ глюкозы. Затем добавлялся буфер того же состава, содержащий 2,8 или 16,7 мМ глюкозы, для измерения глюкозостимулированной секреции инсулина в течение 1 ч. После окончании инкубационного периода супернатанты использовались для измерения инсулина, а β-клетки лизировались для измерения содержания общего белка и АТФ. Использовался лизис-буфер следующего состава: 200 мМ NaCl; 2 мМ ЭДТА; 50 мМ трис-HCl рН 7,4; 1% тритон Х-100. Концентрация инсулина в супернатантах измерялась радиоиммунным методом с использованием набора реактивов Coat-a-Count (DPC, США) [3].

Концентрация общего белка измерялась бицинхониновым методом с применением набора реактивов фирмы "Thermoscientifi c" (США). Концентрация АТФ измерялась люминометрическим методом с использованием люциферазы светляков [4]. Измерения проводились в трех повторностях на планшетном люминометре "TECAN Infi nite M200" в 96-луночных планшетах. Выделение и очистка РНК осуществлялись с использованием набора реактивов Qiagen RNAeasy RNA purifi cation kit ("Hilden", Germany). Обратная транскрипция проводилась с использованием набора Fermentas Rever-tAid™ First-Strand cDNA synthesis kit ("Vilnius", Lithuania). Для ПЦР использовалось 10 нг кДНК и TaqMan ПЦР смесь (AmpliTaq Gold DNA Polymerase, Passive Reference 1, buffer, dNTPs, AmpErase UNG). ПЦР-анализ в режиме реального времени проводился на ПЦР-машине модели на 7900НТ (Applied Biosystems). Ct-значения вычислялись с помощью программного обеспечения ABI PRISM (Applied Biosystems), а относительный уровень экспрессии мРНК вычислялся как разность (ΔCt) целевого гена и референсного гена. Экспрессия мРНК количественно сравнивалась путем расчета величины 2-_ΔΔ Ct.

Для измерения выживаемости β-клеток использовался реагент MTS - внутренняя соль 3-(4,5-диметилтиазол2-ил)-5-(3-карбосиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)2Н-тетразолия, CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay ("Promega", США) [5].

Для получения препарата "Ягель" слоевища лишайника Cladonia предварительно обрабатывали диоксидом углерода в состоянии сверхкритической жидкости (рис. 1А; давление 80 атм.; температура 36°С) в специализированной проточной установке (рис. 1Б) в течение 15 ч для гидролиза водой, содержащейся в тканях слоевищ и активированной (СО₂)_{сверхкритич.}, части β-гликозидных связей в лишайниковых β-полисахаридах с образованием активного вещества БАД "Ягель" - β-полигосахаридов (рис. 2) [6, 7].

Рис. 1. Фазовая диаграмма диоксида углерода (А) и установка для экстракции диоксидом углерода в состоянии сверхкритической жидкости (Б)

Рис. 2. Фрагмент структуры лишайниковых амино-β-олигосахаридов - активного вещества препарата "Ягель"

Полученную твердофазную субстанцию экстрагировали водно-спиртовой смесью (1:1) в соотношении: 2 части сухой массы к 8 частям экстрагента. Экстракция проводилась в течение 14 дн. в темном месте. Полученный экстракт фильтровался через фильтр с размером пор 20 мкм. Статистическая обработка данных проводилась с вычислением t-критерия Стьюдента и использованием пакета программ Sigma Plot для Windows (версия 7.101б SPSS, INC), Statistica (версия 5.0, Statsoft, Inc). Результаты представлены как среднее ± доверительный интервал среднего для указанного числа экспериментов. Достоверность полученных результатов оценивали с использованием соответствующих статистических коэффициентов при уровне значимости тестируемой гипотезы р<0,05.

Результаты и обсуждение

Нами была изучена способность препарата "Ягель" улучшать инсулинсекреторную функцию β-клеток. В эксперименте β-клетки культивировались в стандартной среде RPMI1640 в присутствии препарата (разведение 1:100) в течение 1; 2; 7; 14; 21 и 30 дн. После указанных сроков инкубации β-клеток измерялась их инсулинсекреторная активность в присутствии 2,8 и 16,7 мМ глюкозы (рис. 3). Следует отметить, что в условиях in vitro для β-клеток 2,8 мМ концентрация глюкозы считается оптимальной для поддержания базального уровня секреции инсулина, а 16,7 мМ - оптимальной для стимуляции секреции инсулина.

Рис. 3. Секреция инсулина β-клетками 832/13 в разные периоды инкубации с препаратом "Ягель". Клетки стимулировали глюкозой в концентрации 2,8 и 16,7 мМ в течение 1 ч, n=3; * - р<0,01 по сравнению с клетками, культивированными без экстракта

Как видно из рис. 3Б, на 21 и 30 дн. инкубации с экстрактом наблюдается статистически достоверное увеличение секреции инсулина с 118±4 до 230±10 нг инсулина/ч/мг белка по сравнению с контрольными клетками (р<0,01). При этом секреция инсулина при действии 2,8 мМ глюкозы остается практически одинаковой, что свидетельствует о нетоксичности компонентов препарата "Ягель". Для Р-клеток характерным признаком токсического воздействия является нарушение целостности мембраны и "утечка" инсулина в инкубационную среду даже при базальной концентрации глюкозы. Необходимо отметить, что компоненты препарата не вызывали гибели β-клеток, что было подтверждено MTS-тестом на выживаемость (рис. 4).

Рис. 4. Выживаемость β-клеток крыс "инсулома INS-1 832/13 PD64". Клетки культивированы 48 ч в комплексной среде RPMI1640

Для выяснения возможного механизма действия экстракта Cladonia нами было измерено накопление АТФ в β-клетках. Как видно из рис. 5, при этом отмечалось повышение общего уровня АТФ в β-клетках, инкубированных с препаратом "Ягель" в течение 30 дн., в ходе 1 ч стимуляции с 16,7 мМ глюкозы (111,3±5,4 и 149,3±7,5 нмоль/ ч/мг белка соответственно; р<0,01). Общее содержание АТФ в присутствии разобщителя окислительного фосфорилирования - 40 мкМ карбонилцианидтрифторметоксифенилгидразона (FCCP) и ингибитора АТФ-синтазы - 4 мкг/мл олигомицина было сравнимым в контрольных β-клетках и β-клетках, культивированных с экстрактом (25,9±2,0 и 23,8±1,9 нмоль/ч/мг белка соответственно).

Рис. 5. Накопление АТФ в β-клетках 832/13 через 30 дн. после инкубации с препаратом "Ягель". Клетки стимулировали глюкозой в концентрации 2,8 и 16,7 мМ в течение 1 ч, n=3; * - р<0,05 по сравнению с клетками, культивированными без препарата, стимуляция 2,8 мМ глюкозы; ** - р<0,01 по сравнению с клетками, культивированными без препарата, стимуляция 16,7 мМ глюкозы

Это свидетельствует о том, что разница в содержании АТФ обусловлена именно повышением митохондриальной продукции АТФ в β-клетках. Таким образом, одним из возможных механизмов инсулинотропного действия экстракта из слоевищ лишайника Cladonia является активация метаболизма в митохондриях, приводящая к повышению уровня АТФ - ключевой молекулы в процессе биосинтеза и секреции инсулина.

Показано также, что после 30-дневного инкубирования β-клеток в присутствии препарата "Ягель" повышается экспрессия фактора транскрипции митохондрии Tfam (рис. 6). Tfam является ключевым активатором процесса транскрипции в митохондрии и также участвует в процессе репликации митохондриального генома [8].

Рис. 6. Уровень факторов транскрипции митохондрий Spl и Tfam после 30-дневного инкубирования β-клеток в присутствии препарата "Ягель"

Заключение

Полученные in vitro результаты хорошо согласуются с результатами клинических испытаний. Предварительные испытания у больных, страдающих СД2 (n=98), показали, что в результате 3-4-недельного приема препарата "Ягель" уровень глюкозы крови снижался с 12,4÷14,6 до 6,4÷8,3 мМ. Наиболее значимым показателем в отношении снижения уровня сосудистых осложнений СД2 явилось уменьшение на 17,5÷37,4% содержания гликозилированного гемоглобина при одновременном снижении уровня липопротеидов низкой плотности на 18÷37%. При этом доля больных, находящихся в негативных неспецифических адаптивных реакциях (НАР), уменьшилась с 19,5% до 0, а находящихся в позитивных НАР увеличилась с 47,2 до 71,7% (неопубликованные данные).

По-видимому, выявленный механизм - причина достоверно регистрируемого повышения качества жизни (уровня физической и умственной работоспособности, уменьшения утомляемости и т.д.) больных СД2 после 34-недельного приема препарата "Ягель".

Литература

1. 1. Телятьев В.В. Полезные растения Центральной Сибири. - Иркутск: Восточно-Сибирское кн. изд-во, 1987. - 400 с.
2. 2. Свидетельство о государственной регистрации БАД "Ягель" Роспотребнадзором РФ №77.99.23.3.У.3522.5.08 от 04.05.2008.
3. 3. Шаройко В.В., Чуркин В.А., Кершенгольц Б.М. Усиление гликолиза и подавление митохондриального метаболизма приводит к утрате глюкозостимулированной секреции инсулина в β-клетках // Сибирский мед. журнал. - 2010. - №5. - С. 90-92.
4. 4. Wibom R., Hagenfeldt L., von Dobeln U. Measurement of ATP production and respiratory chain enzyme activities in mitochondria isolated from small muscle biopsy samples // Analytical biochemistry. - 2002. - Vol. 311. - P. 139-151.
5. 5. Zaitseva I.I., Sharoyko V., Sterling J. et al. RX871024 reduces NO production but does not protect against pancreatic beta-cell death induced by proinfl ammatory cytokines // Biochemical and biophysical research communications. - 2006. - Vol. 347. - P. 1121-1128.
6. 6. Кершенгольц Б.М., Журавская А.Н., Ремигайло
7. 7. П.А. и др. Патент РФ №2318407 от 10.03.2008 (приоритет от 10.01.2006).
8. 8. Кершенгольц Б.М., Журавская А.Н., Хлебный Е.С. и др. Биопрепараты из природного арктического биосырья в сохранении здоровья населения в условиях изменений климата // Экология человека. - 2010. - №3. - С. 8-15.
9. 9. Tiranti V., Rossi E., Ruiz-Carrillo A., Rossi G. et al. Chromosomal localization of mitochondrial transcription factor A (TCF6), single-stranded DNA-binding protein (SSBP), and endonuclease G (ENDOG), three human housekeeping genes involved in mitochondrial biogenesis // Genomics. - 1995. - Vol. 25(2). - P. 559-64.