2011 год № 3

Акушерство и гинекология

УДК 610.642 - 053.13/.31 : 618.3](571.6)"2005/.2010"

О.В. Островская¹, E.A. Зайцева³, H.M. Пуховская², Н.М. Ивахнишина¹, И.С. Мусатов², Е.Б. Наговицына¹, М.А. Власова¹, Л.И. Иванов²

Listeria monocytogenes при спонтанных выкидышах и перинатальной смертности

¹Институт охраны материнства и детства СО РАМН, 680022, ул. Воронежская, 49, корп. 1, тел.: 8(42-12)-98-05-91, e-mail: iomid@yandex.ru;
²Хабаровская противочумная станция, 680031, Санитарный пер., 7, тел.: 8(42-12)-33-46-25, г. Хабаровск;
³НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН, 690087, ул. Сельская, 1, тел.: 8(42-32)-44-11-47, г. Владивосток

Контактная информация: О.В. Островская, e-mail: iomid@yandex.ru

Резюме:

В 2005-2010 гг. методом ПЦР изучена инфицированность листериями аутопсийного материала от 146 случаев гибели плодов и новорожденных. В 2005 г. ДНК Listeria monocytogenes обнаружена в 10,3% от числа исследованных. Чаще всего ДНК L. monocytogenes обнаруживали в пробах органов от поздних самопроизвольных абортов - 43,5%. ПЦР-позитивные образцы изучали бактериологически с применением питательных сред. Изолированы штаммы ДНК L. monocytogenes. На инбредных мышах и морских свинках показана вирулентность изолятов. Чаще всего ДНК L. monocytogenes определяли в образцах плаценты, печени, селезенки. Все выделенные штаммы L. monocytogenes имели ферменты, ассоциированные с развитием инфекционного процесса (каталаза, гиалуронидаза, лецитиназа, липолитическая активность), а также гены, кодирующие белки факторов инвазии, - интерналины (inlA, inlB, inC, inlE).

Ключевые слова:

потеря плода, перинатальная смертность, листерии, ПЦР

O.V. Ostrovskaya, E.A. Zaytseva, N.M. Pukhovskaya, N.M. Ivakhnishina, I.S. Musatov, E.B. Nagovitcina, M.A.Vlasova, L.I. Ivanov

Listeria monocytogenes in spontaneous miscarriage and perinatal mortality

Research Institute of Mother and Child Health Care, Siberian Branch of Academy of Medical Sciences, Khabarovsk;
Khabarovsk Plague Control Center;
Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Siberian Branch of Academy of Medical Sciences, Vladivostok

Summary:

Contamination of autopsy material by Listeria was investigated by PCR method in 146 cases of fetus and newborn infant's deaths in the period 2005-2010. In 2005, DNA of Listeria monocytogenes was detected in 10,3% of cases. DNA of L. monocytogenes was found mostly in late spontaneous abortions - 43,5%. PCR-positive samples were examined bacteriologically with the usage of special media. The L. monocytogenes strains were isolated. The virulence of these strains was demonstrated in the inbred mice and guinea pig models. Most frequently, the DNA of L. monocytogenes was revealed in the samples of placenta, liver and spleen. All isolated strains had enzymes, associated with the development of infection process (catalaza, gialuronidaza, lecytinaza, lipolitic activity), and genes, coding the invasive factors proteins - internalins (inlA, inlB, inlC, inlE).

Key words:

fetus lost, perinatal morbidity, Listeria, PCR

Введение

Самопроизвольным прерыванием завершается 20-25% беременностей [5]. Показатель перинатальной смертности на Дальнем Востоке имеет тенденцию к снижению, но превышает российский уровень и показатели высокоразвитых стран. Так, в 2008 г. перинатальная смертность в Дальневосточном федеральном округе составила 9,7‰, в России - 8,3‰ [2]. В Швеции, Финляндии, Германии, Великобритании, США показатель перинатальной смертности варьирует от 5,4 до 7,9‰ [1]. Этиологию потерь плода и новорожденного не удается установить стандартными методами исследования в 40% случаев [4, 8]. Поэтому весьма актуальным является поиск новых методов и подходов для установления причин перинатальных потерь.

Перинатальные потери могут быть связаны с листериозной инфекцией беременных женщин. При заражении во время беременности листерии могут преодолеть плацентарный барьер и вызвать самопроизвольные выкидыши, невынашивание, мертворождение [6, 7, 10]. При попадании в макроорганизм эти бактерии вызывают развитие заболевания, которое обусловлено продукцией ими белковых факторов патогенности, позволяющих листериям проникать в эукариотические клетки и паразитировать в них (белки - интерналины InlA, InlB, Auto, ActA, листериолизин О и др.) [6, 10]. Особая роль продукта гена inlA - белка интерналина А в развитии патологии плода была показана при экспериментальном изучении инвазии листерии в трофобласты [9].

Если до 80-х гг. листериоз был редкой инфекцией, выявляемой преимущественно среди людей, связанных с животноводством, то в настоящее время регистрируются многочисленные эпидемические вспышки листериоза в развитых странах мира, связанные с употреблением в пищу продуктов, контаминированных листериями. Листериоз имеет тенденцию к росту заболеваемости в городах. Этому способствуют высокая заселенность территорий грызунами, большое количество домашних и безнадзорных животных, неконтролируемый на содержание листерии завоз грызунов из-за рубежа, высокая миграция населения, недостаточный уровень диагностики этой инфекции [3].

Целью исследования было изучение участия Listeria monocytogenes в формировании потерь плода и новорожденного.

Материалы и методы

В течение 2005-2010 гг. определяли частоту выявления L.monocytogenes в аутопсийном материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). В 2005 г. исследовали образцы хориальной и плодовой тканей от ранних спонтанных выкидышей (89 случаев на сроке до 16 нед. гестации), пробы органов от поздних выкидышей (23 случая - от 16 до 28 нед. гестации) и перинатальной смерти (34 - на сроке 28-37 нед., из них 17 - мертворожденных и 17 новорожденных, родившихся живыми и умерших в первые 6 дн. жизни). Всего в 2005 г. исследовано 146 случаев гибели плодов и новорожденных, в последующие годы - по 25-30 случаев. ДНК L.monocytogenes выявляли в образцах плаценты, головного мозга, сердца, легких, почек, печени, селезенки, тимуса с помощью диагностических наборов ООО "АмплиСенс". Пробы органов с ПЦР-положительным результатом изучали бактериологическими методами, рекомендованными ГОСТ 51921-2002 и МУК 4.2.1122-02. Сравнивали свойства выделенных из аутопсийного материала штаммов и изолятов листерий из продуктов питания, морских гидробионтов и грызунов, которые были получены из коллекции НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (г. Москва) и музея Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии (ВНИИВМиВ, г. Покров).

Определение генов, кодирующих белки факторов инвазии - интерналины (InlA, InlB, InlC, InlE), осуществляли с использованием праймеров, выбранных на основе последовательностей генов, полученных из базы данных ListiList (http: //www. pasteur.fr), содержащей последовательность генома штамма EGD-e (положительного контроля). Секвенирование фрагментов ДНК проводили в Институте молекулярной биологии им. Энгельгардта в Центре "Геном" (г. Москва). Для статистического анализа использованы ПК и программы Statistica V6.0, Excel 2000 для Windows XP.

Результаты и обсуждение

Возраст матерей погибших плодов и новорожденных с установленной листериозной инфекцией в среднем составил 31,0 г. Беременность была первой только у одной женщины, остальные были повторнобеременными с медицинскими абортами в анамнезе. Антенатальная гибель плода зарегистрирована в анамнезе у 2 женщин, пиелонефрит и гепатит С - у одной. Во время беременности трое перенесли ОРВИ, у двоих установлены субфебрилитет и высокая температура во время беременности и родов, еще у двоих - угроза невынашивания беременности. Масса тела погибших плодов и мертворожденных колебалась от 420 до 1500 г, погибших в неонатальном периоде живорожденных - от 980 до 3880 г.

В 2005 г. исследование проб хориальной и плодовой тканей при ранних выкидышах выявило ДНК L. monocytogenes лишь в одном образце из 89 (1,1±1,1%). При поздних выкидышах обнаружено 10 инфицированных листериями плодов из 23 исследованных (43,5±10,3%). Все зараженные листериями плоды погибли на сроке 24-26 нед. гестации. Частота выявления L. monocytogenes при перинатальной смертности составила 4 случая (11,8±5,5%). В 2005 г. инфицированный листериями материал от погибших плодов и новорожденных был собран в июне-сентябре, в целом зараженность изученных погибших плодов и новорожденных составила 10,3±2,5%. Весной-летом 2006 г. при изучении аутопсийного материала от 25 погибших плодов и новорожденных L. monocytogenes была выявлена в 2 случаях (8,0±5,4%).

В 2007-2010 гг. L.monocytogenes определяли в единичных случаях или не определяли. Причины высокой зараженности листериями материала от поздних выкидышей в 2005 г. (43,5%) остаются неясными. Очевидно, инфицированность листериями погибших плодов и новорожденных колеблется в широком диапазоне, обусловлена многими факторами, в частности ростом зараженности листериями объектов окружающей среды в отдельные годы, завозом партий продуктов, обсемененных листериями. Эти связи могут быть предметом дальнейшего, более глубокого изучения.

Частота определения ДНК L.monocytogenes в отдельных органах варьировала: в пробах плаценты находили возбудителя в 15,3% случаев, печени - 12,3%, селезенки - 12,3%, головного мозга - 10,8%, почек - 7,7%, легких - 1,5%.

Пробы органов, в которых методом ПЦР была выявлена ДНК L.monocytogenes, исследовали бактериологически с применением питательных сред. В результате изолированы штаммы, которые по культуральным и биохимическим свойствам отнесены к патогенному виду L.monocytogenes. Среди выделенных из аутопсийного материала изолятов листерий преобладал серовариант 4b (15 из 22 штаммов), считающийся наиболее опасным в эпидемиологическом плане [6].

Известно, что развитие клинических проявлений листериоза обусловлено наличием факторов патогенности L.monocytogenes, в том числе ферментов, которые могут участвовать в развитии инфекционного процесса (каталаза, гиалуронидаза, лецитиназа, липолитическая активность). Все выделенные штаммы L.monocytogenes имели эти ферменты, были каталазоположительными, продуцировали гемолиз на кровяном агаре, лецитиназу на среде ГРМ №1 с активированным углем, обладали липолитической активностью на средах, содержащих твин 20, 60, 80.

Гиалуронидаза была выявлена у всех изолированных нами культур листерий. Выявлены отличия в ферментативной активности в зависимости от источника выделения, изоляты листерий от погибших плодов и новорожденных обладали более выраженной лецитиназной активностью, чем штаммы из других источников (таблица). Изучение степени вирулентности на белых инбредных мышах и морских свинках показало, что культуры являются неоднородными. Встречались как вирулентные культуры, так и слабовирулентные.

Таблица. Ферментативная активность, связанная с патогенностью L.monocytogenes в зависимости от источника выделения (%)
Фермент. активность	Группы				P
	Погибшие плоды (n=20)	Продукты питания (n=50)	Морские гидробионты (n=20)	Грызуны (n=28)
	1	2	3	4
Каталазная	100,0	100,0	100,0	100,0	1 и 2 р=1,0000 1 и 3 р=1,0000 1 и 4 р=1,0000
Гемолитическая	100,0	100,0	100,0	100,0	1 и 2 р=1,0000 1 и 3 р=1,0000 1 и 4 р=1,0000
Гиалуронидазная	100,0	92,0	60,0	100,0	1 и 2 р=0,1971 1 и 3 р=0,0031* 1 и 4 р=1,0000
Лецитиназная	100,0	79,5	81,8	80,0	1 и 2 р=0,0318* 1 и 3 р=0,0526* 1 и 4 р=0,0387*
Липазная в отношении: - твин 20	20,0	60,0	50,0	82,1	1 и 2 р=0,0035* 1 и 3 р=0,0539* 1 и 4 р=0,0001*
- твин 60	100,0	100,0	100,0	100,0	1 и 2 р=1,0000 1 и 3 р=1,0000 1 и 4 р=1,0000
- твин 80	10,0	62,0	30,0	75,0	1 и 2 р=0,0002* 1 и 3 р=0,1221 1 и 4 р=0,0001*

Примечание. * - различия достоверны.

Выделенные из клинического материала культуры L.monocytogenes были проанализированы с помощью ПЦР на присутствие генов inlA, inlB, inlE, inlC, кодирующих факторы адгезии и инвазии, - интерналины, которые принимают участие в проникновении листерий в эукариотические клетки на начальных этапах их взаимодействия. Проведенный сравнительный анализ по выявлению генов inlA, inlВ, inlE, inlC y L. monocytogenes, выделенных из аутопсийного материала от погибших плодов и новорожденных в Хабаровске, показал, что все изучаемые культуры листерий обладали этими генами.

Выводы

Выявление ДНК L. monocytogenes в аутопсийном материале при спонтанных выкидышах и перинатальной смертности с подтверждением положительных находок, выделением культур листерий и определением их патогенности свидетельствуют о значении листериоза как этиологического фактора в формировании репродуктивных потерь.
Все культуры L.monocytogenes, выделенные из аутопсийного материала от погибших плодов и новорожденных, содержали факторы патогенности, в том числе гены inlA, inlB, inlC, inlE, кодирующие белки - интерналины.
В комплексную диагностику внутриутробных инфекций у беременных с осложненным течением беременности необходимо включать индикацию L.monocytogenes в зеве, моче, особенно при наличии катаральных явлений, гриппоподобного состояния, субфебрилитета.
Изучение аутопсийного материала погибших плодов и новорожденных методом ПЦР на наличие листерий (особенно при преждевременном излитии околоплодных вод или изменении цвета околоплодных вод) целесообразно для определения этиологии перинатальных потерь и выбора реабилитационных мероприятий для матери.

Литература

1. Демидов В.Н. Современные возможности диагностики состояния плода во время беременности // Охрана здоровья матери и ребенка: сб. науч. тр. V Рос. науч. форума. - М., 2003. - С. 376-379.
2. Демографический ежегодник России: стат. сборник. - М.: Росстат, 2008. - 557 с.
3. Родина Л.В. Организация эпидемиологического надзора за листериозом в условиях г. Москвы: автореф. дис. ... канд. мед. наук. - М., 2003. - 24 с.
4. Серов В.Н., Сидельникова А.Н. Руководство по практическому акушерству. - М.: Триада-Х, 2002. - 304 с.
5. Сидельникова В.Н. Привычная потеря беременности. - М.: Триада-X, 2000. - 304 с.
6. Тарковский И.С., Малеев В.В., Ермолаева С.А. Листерии: роль в инфекционной патологии человека и лабораторная диагностика.- М.: Медицина для всех, 2002. - 200 с.
7. Aljicevic M., Beslagic E., Zvizdic S. et al. Listeria monocytogenes in women of reproductive age // Med. Arh.2005. - Vol. 59. - P. 297-298.
8. Skjolderbrand - Spare L., Tolfenstam Т., Paradogiannakis N. et al. Parvovirus В 19 infections: association with third trimester intrauterine fetal death // British Journal of Obstetrich and Gynaecology. - 2000. - Vol. 107. - P. 476-480.
9. Lecuit M., Nelson D.M., Smith S.D. et al. Targeting and crossing of the human maternofetal barrier by Listeria monocytogenes: Role of internalin interaction with trophoblast E-cadherin // PNAS. - 2004. - Vol. 101, №16. - P. 6152-6157.
10. Vazquez-Boland J.A., Kuhn M., Berche P. et al. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants // Clin. Microbiol. Rev. - 2001. - Vol. 14. - P. 584-640.