2012 год № 3

Резюме:

Ключевые слова:

Summary:

Key words:

Введение

До настоящего времени проблема острых кишечных инфекций (ОКИ) является одной из актуальных практически во всех странах мира ввиду широкой распространенности данной патологии, высоких уровней заболеваемости и, как следствие, значительного экономического ущерба, приносимого ОКИ. [6] Наряду с традиционными возбудителями данных инфекций (сальмонеллами, шигеллами), все большую роль в развитии этой патологии начинают играть и другие микроорганизмы. В частности, на долю кишечных заболеваний, вызываемых кампилобактериями, приходится (в зависимости от сезона и особенностей региона) от 2 до 38% всех случаев диарей [6]. Особенностью метаболических характеристик этих патогенов является полное отсутствие у них сахаролитических свойств. Поэтому и нутритивные метаболические процессы, и формирование спектра факторов патогенности идет в границах белкового и липидного обмена. Изучение этих свойств представляет интерес в том числе потому, что ряд метаболических тестов (стабильных у штамма, но вариабельных в популяциях) используется в некоторых схемах субвидового типирования кампилобактерий [3]. Целью данной работы являлось исследование липолитической активности клинических штаммов кампилобактерий в отношении ряда субстратов.

Материалы и методы

Все культуры данных микроорганизмов, использованные в работе, имели клиническое происхождение. Они были выделены от больных детей, поступивших в инфекционный стационар с симптоматикой острых диарейных заболеваний. Всего в работе использовано 72 культуры кампилобактерий. Установление родовой и видовой принадлежности возбудителей проводилось в соответствии с общепринятыми схемами диагностики [2, 4]. Все штаммы кампилобактерий относились к виду Campylobacter jejuni.

Липолитическая активность культур кампилобактерий оценивалась в тестах на продукцию лецитиназы и гидролиз эфиров жирных кислот (твинов). Твиназная активность с анализом спектра, характерного для конкретного штамма, исследовалась согласно методике Л.С. Бузолевой с соавт. [1] с предложенными нами изменениями, касающимися биологических потребностей данных возбудителей. В качестве субстратов в этой серии экспериментов использовались следующие препараты: твин-20 (эфир лауриновой кислоты), твин-40 (эфир пальмитиновой кислоты), твин-60 (эфир стеариновой кислоты), твин-80 (эфир олеиновой кислоты). В качестве среды для проведения этого исследования применяли триптозный агар с добавлением к нему гидратированного CaCl² с конечным содержанием 0,01% и твин-субстратов в следующих концентрациях: твин-20 - 1%, твин-40, -60 и -80 - по 0,25%. На приготовленную по этой прописи среду бляшками засевали изучаемые культуры кампилобактеров, и инкубировали посевы в микроаэрофильных условиях при 37°С в течение 48 ч. Наличие у бактерий липолитической активности (положительный результат) приводило к образованию в среде вокруг колоний данного микроба осажденных кристаллов кальциевого мыла, что визуально определялось как мутный ореол, окружающий бляшечный посев такого штамма. В качестве плюс-контролей при проведении данных исследований использовались заведомо положительные штаммы энтеробактерий. Тесты на гидролиз твина-40 и твина-60 используются в схеме внутривидового типирования кампилобактерий [3].

Способность штаммов изучаемых возбудителей к продукции лецитиназы исследовали согласно рекомендациям [5] с некоторыми нашими модификациями, учитывающими биологические особенности кампилобактеров. На поверхность свежеприготовленного триптозного агара с добавлением яичного желтка бляшками засевали культуры микроорганизма. Все посевы инкубировали микроаэрофильно при 37°С в течение 48 ч. В случае наличия у штамма способности к продукции лецитиназы, вокруг выросших колоний появлялась радужная зона в виде "венчика" вследствие расщепления лецитина. В качестве положительного контроля применяли лецитиназоактивный штамм S. aureus.

Результаты и обсуждение

При исследовании лецитиназной активности штаммов кампилобактерий у 8 из них (11,1 ± 3,7%) обнаружена способность продуцировать этот фермент. Поскольку лецитиназа бактерий рассматривается как фермент патогенности, эти данные определенным образом характеризуют вирулентный потенциал выделенных возбудителей.

Липолитическая активность кампилобактерий была также исследована на комплексе твин-субстратов. Проанализирована как твиназная активность возбудителей в целом, так и спектры данных метаболических реакций у конкретных штаммов. Было выявлено, что ферментативная активность в отношении этих липоидных веществ является распространенным явлением в популяции возбудителей кампилобактериозных инфекций. У 46 штаммов данных микроорганизмов (63,8 ± 5,7%) обнаруживалась способность метаболизировать используемые в опыте субстраты. При этом почти в половине случаев спектр липолитической активности бактерий ограничивался только одним из твинов (у 30,5 ± 5,4% штаммов). Утилизация одновременно двух предлагаемых субстратов также выявлялась у 30,5 ± 5,4% изучаемых культур, а положительная липазная реакция в отношении трех твинов в различных сочетаниях наблюдалась у 2,8 ± 1,9% штаммов. Можно отметить, что чаще всего липолитическая активность кампилобактерий проявлялась в отношении эфиров насыщенных жирных кислот (твин-40 и твин-60). В целом, из всех липолитически активных штаммов кампилобактеров способность к ферментации эфиров насыщенных жирных кислот обнаруживалась, соответственно: в отношении твина-40 - у 86,6 ± 5,0% культур, а в отношении твина-60 - у 28,9 ± 6,7% культур. Гораздо реже в популяции данных возбудителей выявлялись штаммы, обладающие липолитической активностью в отношении эфиров ненасыщенных жирных кислот (твин-20 и твин-80). В целом, на средах с добавлением первого субстрата (твин-20) положительная липазная реакция наблюдалась только у 17,8 ± 5,6% липолитически активных культур кампилобактерий. Метаболизировать твин-80 были способны 26,7 ± 6,5% штаммов из указанной группы возбудителей. Полная характеристика спектров липолитической активности кампилобактерий в отношении твинов представлена в таблице.

Все указанные метаболические реакции штаммов возбудителей характеризовались стабильностью и стандартностью воспроизведения.

Выводы

1. Липолитическая активность является важной биологической характеристикой клинических штаммов кампилобактерий. Положительный лецитиназный фактор патогенности был у 11,1 ± 3,7% клинических изолятов, а гидролиз твинов наблюдался у 63,8 ± 5,7% штаммов.
2. При общей выраженности твиназной активности культур кампилобактеров имеется заметная вариабельность данного признака в популяции микроорганизмов с большим разнообразием спектров положительных липазных реакций.
3. Разнообразие твиназных спектров в сочетании со стабильностью воспроизведения результатов у конкретных штаммов позволяет рассматривать их как возможные "метки" для внутривидового биотипирования кампилобактерий. Причем это касается как твина-40 и твина-60, так и твинов-20 и -80.

Литература

1. 1. Бузолева Л.С., Пручкина З.В. Метод определения липазы бактерий кишечной группы // Лаб. дело. - 1990. - № 12. - С. 74-75.
2. 2. Микробиологическая диагностика кампилобактериоза: метод. рек. - М.: Фед. центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2008. - 25 с.
3. 3. Минаева Н.З. Внутривидовое типирование кампилобактеров как элемент эпидемиологического надзора за кампилобактериозом: автореф. дис. … канд. мед. наук. - М., 1992.
4. 4. Черкасский Б.Л., Воротынцева Н.В., Ющук Н.Д. и др. Инструкция по клинической и лабораторной диагностике кампилобактериоза. - М., 1989.
5. 5. Чистович Г.Н. Стафилококковая лецитиназа // ЖМЭИ. - 1950. - № 10. - С. 54-57.
6. 6. Newell D.G., Kettley J.M., Feldman R.A. Campylobacters, Helicobacters and Related Organisms. - N. Y.: Plenum Press, 1997. - Р. 751.