2013 год № 4

Резюме:

Ключевые слова:

Summary:

Key words:

Введение

Мировая пандемия вирусного гепатита С является одной из самых актуальных проблем современной медицины, что обусловлено не только его широкой распространенностью, но и латентностью течения, высокой частотой хронизации, выраженностью неблагоприятных исходов - цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы, которые являются ведущими в структуре смертности от заболеваний печени.

К сожалению, в мире еще не создана вакцина против гепатита С и ВОЗ прогнозирует, что к 2015 году показатель заболеваемости вирусным гепатитом С может утроиться [9]. Россия не является исключением. Еще на VIII Всероссийском съезде эпидемиологов Главный санитарный врач РФ Г.Г. Онищенко (2002) особо отметил неуклонный рост заболеваемости гепатитом С в стране. Предполагается, что к 2015-2020 гг. увеличится частота выявления хронического гепатита С на стадии цирроза печени и возрастет количество HCV-ассоциированной гепатокарциномы [6].

В настоящее время считается установленным, что высокая частота (50-85 % по данным различных авторов) формирования хронических форм и развития осложнений обусловлена "ускользанием" вируса от иммунного надзора [5, 7]. Механизмы этого феномена до сих пор четко не установлены. Предполагается, что центральную роль в элиминации вируса гепатита С играет Т-клеточное звено иммунитета [1, 8]. Существенное значение в поддержании патологического процесса у больных придается недостаточности CD4+Т-хелперов и дисбалансу цитокинов [9].

Таким образом, основную роль в формировании характера иммунного реагирования макроорганизма играет взаимодействие в системе "вирус-хозяин", что определяет сценарий развития событий при HCV-инфекции [4]. В тоже время многие аспекты иммунного ответа при гепатите С остаются невыясненными, хотя это актуально как в теоретическом аспекте для понимания иммунопатогенеза, так и в практическом плане для прогноза течения болезни.

Целью настоящей работы стало изучение иммунного статуса больных хроническим вирусным гепатитом С.

Материалы и методы

Было обследовано 69 человек, находившихся на стационарном лечении в ГУЗ "Краевая клиническая инфекционная больница" г. Читы за период с 2011 по 2013 гг. по поводу хронического вирусного гепатита С. Женщин было 30,4 % (21), мужчин - 69,6 % (48). Обследованные находились в возрасте от 16 до 58 лет, средний возраст - 36±1 лет. От всех пациентов получено добровольное информированное согласие на участие в исследовании.

Диагноз хронического вирусного гепатита С выставлен на основании клинико-лабораторных данных и обнаружения РНК HCV методом ПЦР. Длительность заболевания до 5 лет выявлена у 66,7 %, свыше 5 лет - у 33,3 %. Первая степень биохимической активности процесса определялась у 55,0 % больных ХВГС, вторая - у 45,0 %. Стадия заболевания по Metavir F 0-F 1 была диагностирована у 43,5 %; F 2 - у 42,0 %; F 3-F 4 - у 14,5 %.

Кровь для иммунологического обследования получали путем пункции локтевой вены в строго стерильных условиях на 2-3-и сутки стационарного лечения. Взятие крови осуществляли в утренние часы (8-9 часов) строго натощак. Для иммунофенотипирования кровь забирали в пробирку VACUTAINER (BD), содержащую динатриевую соль ЭДТА объемом 2,5 мл.

Изучались активность и количество Lymphocytes (CD45+), T-cell (CD3+), T-help (CD3+CD4+), T-killer (CD3+CD8+), T-cellAktiv (CD3+HLA-DR+), T-helpAktiv (CD3+CD4+HLA-DR+), T-killAktiv (CD3+CD8+HLA-DR+), B-cell (CD19+), NK-cell (CD3-CD16+CD56+), T-NK-cell (CD3+CD16+CD56+).

Оценку субпопуляционной структуры лимфоцитов осуществляли стандартным методом прямого пяти-параметрического иммунофлюоресцентного окрашивания цельной крови с использованием коммерческого лизирующего/фиксирующего раствора OPTILYSE С (Beckman Coulter) и панели моноклональных антител tetraCHROME™ и IOTest (Beckman Coulter): 1-я панель - CD45-FITC/CD4-RD1/CD8-ECD/CD3-PC5 и HLA-DR-PC7; 2-я панель - CD45-FITC/CD56-RD1/CD19-ECD/CD3-PC5 и CD16-PC7. Контрольные пробы инкубировали с иммуноглобулинами, мечеными флуорохромами (FITC, RD1, ECD, PC5, PC7) соответствующего изотипа - мышиные IgG1, IgG2a IOTest (Beckman Coulter). Цитофлюорометрию осуществляли на проточном цитофлюориметре "Cytomics FC-500" (Beckman Coulter, USA), регистрировали суммарно не менее 10 тысяч событий. Данные анализировали с помощью программы CXP Cytometer (Beckman Coulter).

Определение показателя лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии (ЛТА) проводили по методу, предложенному Ю.А. Витковским и соавт. (1999) [2]. Свежую гепаринизированную кровь обследуемых больных наслаивали на градиент урографин-фикол (плотность - 1,077) и выделяли лимфоциты. Собирали интерфазное кольцо, содержащие клетки и кровяные пластинки, однократно промывали фосфатно-солевым буфером (рН 7,4) и центрифугировали при 1000 об./мин. в течение 3-4 минут. Надосадочную жидкость сливали, осадок микроскопировали в камере Горяева. Показатель ЛТА выражали числом лимфоцитарно-тромбоцитарных коагрегатов на 100 клеток (норма - 13-15 %). Степень адгезии (ЛТИ) определяли как число кровяных пластинок, адгезированных на поверхности одного лимфоцита (норма - 3,0±0,3).

Статистическая обработка полученных результатов осуществлялась с использованием пакета анализа Microsoft Excel. Она включала описание выборки, нахождение средней арифметической, среднеквадратического отклонения и ошибки средней арифметической, определялись частоты встречаемости признаков, группировка данных.

Результаты и обсуждение

Установлено, что у всех больных хроническим вирусным гепатитом С изменены показатели иммунограммы, по сравнению с нормой. Средние значения показателей иммунограммы представлены в таблице 1; отклонения от нормы - в таблице 2.

Так, у 44,9 % обследованных относительное количество лимфоцитов оказалось сниженным (21,8 0,8 %), при этом, абсолютное число лимфоцитов было снижено только у 8,7 %. Процент субпопуляции лимфоцитов CD3+CD4+ был повышен у 23,2 % пациентов (59,3 0,8 %), субпопуляции CD3+CD8+ - у 17,4 %.

В 50,7 % случаев обнаружены изменения в клеточном звене иммунитета: у 31,9 % больных выявлено снижение (1,13±0,05) иммунорегуляторного индекса (CD4+/CD8+), у 18,8 % больных иммунорегуляторный индекс был повышен (3,22±0,22).

Популяция активированных Т-лимфоцитов (CD3+HLA-DR+) была существенно увеличена у 53,9 % обследованных (14,43 2,10 %; 302,43 40,81). В 89,9 % случаев установлено снижение активированных Т-хелперов (CD3+CD4+HLA-DR+) - 1,94 0,11 %. Одновременно с этим у 69,6 % пациентов была снижена субпопуляция активированных Т-киллеров (CD3+CD8+HLA-DR+) - 2,03 0,15 %. Выявлено значительное снижение относительного и абсолютного количества популяции CD3-CD16+CD56+ у 82,6 % больных: 2,26 0,27 % и 45,70 5,88 соответственно.

Субпопуляция CD19+ была сниженной в 30,4 % случаев (4,8 0,3 %), повышенной - в 15,9 % случаев (19,13 0,63). Процент CD3+CD16+CD56+ был снижен у 50,7 % больных (0,17 0,03 %), у 21,7 % был повышен процент CD3+ (88,89 0,86 %).

В настоящее время широко изучаются межклеточные взаимодействия, особенно между системой гемостаза и иммунитета. Установлено, что тромбоциты имеют отношение к протеканию воспалительных реакций: адгезивные взаимодействия между тромбоцитами и лейкоцитами являются важными звеньями механизмов, обеспечивающих миграцию лейкоцитов в зону повреждения, а, следовательно, воспаления и развития иммунных и репаративных реакций [2, 3]. Этот феномен получил название лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии.

Установлено, что у больных хроническим вирусным гепатитом С общий показатель ЛТА является пониженным - 9,13 0,56 %. Одновременно с этим уменьшенным было и среднее число тромбоцитов, вступивших в контакт с лимфоцитами - 2,60 0,12.

Т. е. показатель лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии был ниже нормы у 73,8 % обследованных пациентов (7,30 0,45 %), выше - у 11,5 %; показатель ЛТИ оказался ниже нормы в 47,5 % случаев (1,82 0,11), выше - в 27,1 %.

Выводы

Таким образом, противовирусный потенциал у больных хроническим вирусным гепатитом С обеспечивается выраженным ростом популяции активированных Т-лимфоцитов (CD3+HLA-DR+) при значительном снижении популяций активированных Т-хелперов (CD3+CD4+HLA-DR+), активированных Т-киллеров (CD3+CD8+HLA-DR+), NK-клеток (CD3-CD16+CD56+) и T-NK-клеток (CD3+CD16+CD56+), что является проявлением дизрегуляции клеточного иммунитета и отражает иммунопатогенез HCV-инфекции.

При этом установлено снижение лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии у больных ХВГС в 73,8 % случаев, что свидетельствует о дисфункции Т-лимфоцитов, проявляющейся в уменьшении их способности к адгезии тромбоцитов.

Вышеизложенное позволяет рекомендовать определение иммунограммы и использование теста лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии для оценки иммунитета у больных вирусным гепатитом С.

Литература

1. 1. Баранов А.В. Эпидемиологические факторы и клинико-иммунологические аспекты патогенеза хронического гепатита С: автореферат дис. … д-ра мед. наук. - М., 2009. - 47 с.
2. 2. Витковский Ю.А., Кузник Б.И., Солпов А.В. Феномен лимфоцитарно-тромбоцитарного розеткообразования // Иммунология. - 1999, № 4. - С. 35-37.
3. 3. Гергесова Е.Е., Витковский Ю.А., Солпов А.В. Агрегация тромбоцитов, лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия и группы крови АВ0 у больных гриппом A(H1N1) / 2009 // ЭНИ Забайкальский медицинский вестник. - 2011, № 1. - С. 4-9.
4. 4. Марченко Л.И. и др. Оценка иммунологической реактивности больных хроническим вирусным гепатитом С // Материалы VI Российского съезда врачей-инфекционистов. - СПб., 2003. - С. 381.
5. 5. Мухин Н.А. "Трудный" больной в гепатологии // Гепатологический форум (приложение к журналу "Клиническая фармакология и терапия"). - 2005, № 1. - С. 6-8.
6. 6. Онищенко Г.Г. Ситуация и меры борьбы с вирусными гепатитами в Российской Федерации // Мед. кафедра. - 2002. - № 2. - С. 18-22.
7. 7. Орлова И.И., Зайнудинов 3.М., Каганов Б.С. Хронический гепатит С // Вопросы современной педиатрии. - 2004. - Т. 3, № 4. - С. 37-47.
8. 8. Семененко Т.А. Клеточный иммунный ответ при гепатите С // Вирусные гепатиты. - 2000, № 1. - С. 11-17.
9. 9. Скляр Л.Ф. Система цитокинов и показатели оксидативного стресса при хроническом гепатите С с учетом иммунокорригирующей терапии: дис. … канд. мед. наук. - Владивосток, 2006. - 270 с.