2014 год № 3

Фармакология и фармация

УДК 615.015.23:543.2

А.В. Бабьяк¹, Е.В. Компанцева²

Разработка и валидация методики определения верапамила гидрохлорида в фармацевтической композиции методом ВЭЖХ

¹Дальневосточный государственный медицинский университет, 680000, ул. Муравьева-Амурского 35, тел. 8-(4212)-32-63-93, e-mail: nauka@mail.fesmu.ru, г. Хабаровск;
²Пятигорский медико-фармацевтический институт, 357532, пр. Калинина, 11, тел. 8-(793)-32-33-37, e-mail: canpgfa84@mail.ru, г. Пятигорск

Контактная информация: А.В. Бабьяк, e-mail: annav.babyak@gmail.com

Резюме:

В настоящей статье описана методика определения верапамила гидрохлорида в фармацевтической композиции гипотензивного действия, куда он входит в составе таблеток продленного действия. Цель представленной работы заключается в разработке и валидационной оценке аналитической методики количественного определения верапамила в лекарственной форме методом ВЭЖХ. В ходе работы обоснован экстрагент для извлечения исследуемого вещества из таблеточной массы, разработаны условия ВЭЖХ определения. Валидация методики была проведена по параметрам: специфичность, линейность, правильность и повторяемость. Установлено, что по всем представленным параметрам методика отвечает требованиям нормативных документов.

Ключевые слова:

верапамила гидрохлорид, ВЭЖХ, валидация

А.V. Babyak¹, Е.V. Kompanceva²

Development and validation of verapamil hydrochloride determination in a pharmaceutical composition by HPLC

¹Far Eastern State Medical University, Khabarovsk;
²Pyatigorsky branch of the State Budgetary Educational Establishment of Higher Professional Education "Volgograd State Medical University" of the Ministry of Public Health Services of the Russian Federation, Pyatigorsk

Summary:

This article describes the method of determination of verapamil hydrochloride in a pharmaceutical composition with a hypotensive action, where it is included as a part of prolonged action tablets. The purpose of the presented work is development and validation of analytical technique of quantitative determination of verapamil in pharmaceutical composition by HPLC-method. During the experiment, the extractant is selected for extraction of an analyte from the tablet mass, HPLC determination conditions were determined. Validation methodology was carried out based on the parameters: specificity, linearity, accuracy and precision. The authors revealed that all the parameters of the presented technique meet the requirements of normative documents.

Key words:

verapamil hydrochloride, HPLC, validation

Введение

Верапамила гидрохлорид является представителем группы антагонистов кальция. Помимо гипотензивного эффекта, он обладает выраженным антиаритмическим и антиатерогенным действием, метаболической нейтральностью, что делает его одним из препаратов выбора для комбинированной лекарственной терапии [1].

В ходе ранее проведенных исследований нами была разработана фармацевтическая композиция, в состав одной капсулы которой верапамила гидрохлорид входит в виде 4 таблеток продленного действия и лизиноприл в виде гранул [2].

Цель настоящей работы заключается в разработке и валидации ВЭЖХ методики для количественного определения верапамила гидрохлорида в фармацевтической композиции гипотензивного действия.

В статье представлены результаты валидации разработанной методики по параметрам: специфичность, линейность, правильность и повторяемость.

Материалы и методы

В работе использовались приборы: жидкостный хроматограф Agilent 1260 Infinity с колонкой Luna 5u длиной 25 мм с сорбентом Силасорб С18; рН-метр ионометр 410; аналитические весы марки Т-А-13.

Верапамила гидрохлорида в одной капсуле содержится в дозе 100 мг в виде 4 таблеток по 25 мг. В связи с этим, состав таблеток продленного действия (в пересчете на 1 таблетку):

Верапамила гидрохлорид - 25 мг;

Натрия альгината - 50 мг;

Микрокристаллическая целлюлоза (МКЦ) - 15 мг;

Магния стеарат - 0,6 мг;

Plasdone K-90 - 7,5 мг.

Определение валидационных параметров методики проводили на модельных смесях таблеток верапамила гидрохлорида в пересчете на одну дозу вещества (100 мг).

Растворы модельных смесей таблеток верапамила гидрохлорида и стандартного образца (СО) верапамила гидрохлорида для измерения площади пиков готовили в концентрации 0,1 мг/мл.

Методика. Около 0,4 г (точная навеска) порошка модельной смеси растертых таблеток верапамила гидрохлорида помещали в мерную колбу вместимостью 10 мл, встряхивали с 3 мл метанола в течение 10 мин., раствор доводили до метки этим же растворителем. Осадок отфильтровывали с помощью фильтра типа "синяя лента". 1 мл полученного раствора помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяли в воде и доводили этим же растворителем до метки. Раствор фильтровали через фильтр типа "синяя лента", измеряли площади пиков.

В качестве подвижной фазы (ПФ) была выбрана система растворителей: фосфатный буферный раствор (рН=3,0) - ацетонитрил - изопропанол в соотношении 30:35:35, режим элюирования изократический. Скорость потока ПФ 0,8 мл/мин., объем пробы 20 мкл, температура термостата колонки 40 °С. Детектирование осуществляли с помощью УФ-детектора при длине волны 278 нм. В колонку хроматографа попеременно вводили равные объемы раствора СО верапамила гидрохлорида и растворы испытуемых модельных таблеток, измеряли площади пиков.

Результаты и обсуждение

На первом этапе для проведения анализа необходимо было подобрать растворитель для извлечения верапамила гидрохлорида из таблеточной массы. Использование водных растворителей не представлялось возможным, т. к. входящий в состав таблеток натрия альгинат медленно растворяется в воде, образуя вязкий гель. Учитывая растворимость верапамила гидрохлорида и вспомогательных веществ, нами было предложено использовать метанол, который эффективнее, чем этанол извлекает действующее вещество и в котором нерастворим натрия альгинат.

В качестве подвижной фазы нами была выбрана система: фосфатный буферный раствор (от 10 до 90) - ацетонитрил (от 10 до 90), без включения аминов и их производных, изократический режим элюирования и детектирование при 278 нм [5, 6]. В предложенных условиях на хроматограммах модельных смесей таблеток верапамила гидрохлорида фактор асимметрии пика верапамила и разрешение между пиком исследуемого вещества и пиком вспомогательных веществ не соответствовали требованиям НД [3]. Оптимальные результаты мы получили при введении в ПФ в качестве третьего компонента раствора изопропилового спирта. Соотношение растворителей фосфатный буферный раствор (рН 3,0) - ацетонитрил - изопропанол при этом составило 30:35:35.

Валидацию разработанной методики проводили в соответствии с проектом ОФС 42-0113-09 "Валидация аналитических методик".

Специфичность разработанной методики определяли путем сравнения хроматограмм модельных таблеток верапамила и плацебо-смеси. Время удерживания (t_R) исследуемого вещества на хроматограмме СО верапамила составляет 3,29 минуты. На хроматограммах модельных таблеток верапамила помимо пика основного вещества с t_R=3,29 мин. зафиксирован пик с t_R=2,20 мин. На хроматограмме плацебо-смеси обнаружен пик, время удерживания которого также составляет 2,20 мин, а пик исследуемого вещества отсутствует (рисунок).

Рис. Хроматограмма модельных таблеток верапамила гидрохлорида (2) и плацебо-смеси (1)

Согласно растворимости вспомогательных веществ, пик на хроматограмме смеси "плацебо" соответствует PlasdoneK-90. В соответствии с полученными результатами установлено, что присутствие вспомогательных веществ не мешает определению верапамила гидрохлорида в таблетках.

Линейность определяли путем измерения площади пиков извлечений из 5 образцов модельных смесей таблеток верапамила гидрохлорида с содержанием действующего вещества 80, 90, 100, 110 и 120 %. Установлено, что аналитическая область методики, находящаяся в диапазоне 0,8-1,2 мг/мл, входит в пределы линейной зависимости и описывается уравнением у=14 959х -269,6 с коэффициентом корреляции r=0,999.

Правильность предлагаемой методики определяли на 6 образцах модельных смесей таблеток с известным содержанием верапамила гидрохлорида.

С целью проверки повторяемости методики проводили трехуровневый эксперимент по 3 опыта на каждом уровне. Диапазон измерения был выбран исходя из варьирования содержания верапамила в одной дозе лекарственной формы (±20 %).

Общие результаты валидационной оценки ВЭЖХ определения верапамила гидрохлорида в модельных смесях таблеток представлены в таблице.

Таблица. Результаты валидационной оценки ВЭЖХ методики определения верапамила гидрохлорида
Наименование показателя	Оптимальное значение (НД)	Результат определения	Соответствие требованиям НД [3, 4]
Специфичность	однородность пика	пик определяемого вещества четко отделяется от пиков вспомогательных веществ	+
Аналитическая область	результаты должны иметь приемлемый уровень правильности и повторяемости	методика применима в интервале от 80 до 120 % от номинального значения содержания вещества в модельных таблетках	+
Линейность (коэффициент корреляции r)	\|r\|≥ 0,99	0,999	+
Правильность (критерий Стьюдента)	≤2,57	0,82	+
Повторяемость (относительное стандартное отклонение RSD)	≤3 %	1,63 %	+

Согласно представленным данным для разработанной методики выполняется условие линейной зависимости у=14 959х -269,6 (|r|≥0,990,99), правильности (t_выч.табл. (Р, f)), повторяемости (RSD≤3 %).

Выводы

В ходе экспериментальной работы предложена методика количественного определения верапамила гидрохлорида в фармацевтической композиции методом ВЭЖХ. При помощи валидационной оценки установлено, что разработанная методика ВЭЖХ валидна по показателям: специфичность, аналитическая область, линейность, правильность, повторяемость.

Литература

1. Диагностика и лечение артериальной гипертензии: Российские рекомендации (четвертый пересмотр) // Системные гипертензии. - 2010. - № 3. - С. 5-26.
2. Компанцева Е.В. Разработка состава и технологии таблеток верапамила с контролируемым высвобождением действующего вещества // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2013. - № 3. - С. 17-20.
3. Сапрыкин Л.В. Практика и методические основы ВЭЖХ. - М., 2006. - 151 с.
4. Эпштейн Н.А. Оценка пригодности (валидация) ВЭЖХ методик в фармацевтическом анализе (обзор) // Химико-фармацевтический журн. - 2004. - Т. 38, № 4. - С. 40-56.
5. HPLC method for determination of verapamil in human plasma after solid-phase extraction // Journal of Biochemical and Biophysical Methods. - 2008. - Vol. 70, № 6. - P. 1297-1303.
6. Ho P.C. Simultaneous HPLC analysis of S- and R-verapamil and metabolites, S- and R-norverapamil in human plasma // J. Liq. Chromatogr. and Relat. Technol. - 2000. - Vol. 23, № 11. - P. 1711-1723.