2015 год № 2

Теоретическая и экспериментальная медицина

УДК. 615.275.4: 612.35] 577.352.335

В.И. Тиханов

Реципрокность в продуктах перекисного окисления липидов микросом печени, фракции свободных жирных кислот печени на фоне введения пилокарпина, атропина in vivo в период холодового воздействия

Амурская государственная медицинская академия, 675000, ул. Горького, 95, тел. 8-(4162)-31-90-09, e-mail: amurgma@list.ru, г. Благовещенск

Контактная информация: В.И. Тиханов , е-mail: tikchanov@yandex.ru

Резюме:

Определена реципрокность в показателях перекисного окисления липидов - диеновых коньюгатах (ДК), гидроперекисях (ГП), малонового диальдегида (МДА) мембран эндоплазматического ретикулума печени (микросомы печени). Определено присутствие реципрокности в ДК, ГП, метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК) С₂₀, йодного числа фракции свободных жирных кислот (СЖК) печени после холодовой нагрузки и введения животным пилокарпина, атропина. Реципрокность отмечена и при определении содержания адреналина, молекулярного кислорода гомогената печени. Полученные данные позволяют высказывать предположения о возможном участии периферических мускарино-чувствительных рецепторов G-белков плазматической мембраны гепатоцитов в формировании ПОЛ печени.

Ключевые слова:

продукты ПОЛ, метиловые эфиры жирных кислот, пилокарпин, атропин

V.I. Tikhanov

Reciprocity in products of lipid peroxidation of liver microsomal fractions, of liver fraction free fatty acids with administration of pilocarpine, atropine in vivo during cold exposure

Amur State Medical Academy, Blagoveshchensk

Summary:

Reciprocity is defined in terms of components of lipid peroxidation of liver - diene conjugates (DC), hydroperoxide (HP), malondialdehyde (MDA) the membrane of the endoplasmic reticulum of the liver (liver microsomes). Reciprocity was also defined in the presence of DC, HP, fatty acid methyl esters (FAMEs) C₂₀, iodine value of the fraction of free fatty acids (FFA) liver after injection of the animals pilocarpine, atropine and cold load. Reciprocity was observed while determining the content of adrenaline, molecular oxygen liver homogenate. The data obtained allow speculating on the possible involvement of peripheral muscarine - sensitive receptor G-proteins of the plasma membrane of hepatocytes in the formation of liver lipid peroxidation.

Key words:

products of lipid peroxidation, fatty acid methyl esters, pilocarpine, atropine

Введение

Накопление антихолинэстеразными механизмами эндогенного ацетилхолина (АЦХ) в ткани печени [2], введение экзогенного АЦХ в ткань печени in situ приводит к изменению содержания продуктов ПОЛ печени [12]. Полученные результаты позволяют продолжить работу с фармакологическими агентами, работающими в области холинергических структур печени.

Оценивая влияние фармакологических агентов пилокарпин, атропин на ПОЛ печени, использовали приём экспериментальной фармакологии реципрокность [8]. В предыдущих работах проявление реципрокности отмечали только при определении содержания гидроперекисей (ГП) в общих липидах (ОЛ) и при определении йодного числа ОЛ печени.

Поэтому, целью данной работы явилась выявление реципрокности в диеновых коньюгатах (ДК), ГП, малонового диальдегида (МДА) мембран эндоплазматического ретикулума гепатоцитов (микросом печени), оценки реципрокности в ДК, ГП, метиловых эфирах жирных кислот (МЭЖК) С₂₀, йодного числа фракции свободных жирных кислот (СЖК) печени, после холодовой нагрузки животных и введении пилокарпина, атропина и определение реципрокности в содержании адреналина, молекулярного кислорода гомогената печени.

Материалы и методы

Работа выполнялась на белых, беспородных крысах - самцах массой до 200 гр. Выбор экспериментальных животных основывался на задачах экспериментов [1]. Охлаждение животных проводилось в климатокамере при температурном режиме - 12 °С, на протяжении 3 часов, в течение 5 дней [7]. Основой определения адреналина в гомогенате печени являлось определение триоксииндолов методом флюорометрии в интервале волны возбуждения 310-320 нм [3]. Содержание молекулярного кислорода в гомогенате печени определялось полярографическим методом [15]. ДК, ГП мембран эндоплазматического ретикулума гепатоцитов (микросомы печени) определяли во фракции ОЛ микросом печени. ОЛ экстрагировали из приготовленных микросом печени методом Фолча [5] и Блайя - Дайлера [19]. В основе метода определения ДК и ГП лежали методы, описанные Стальной И.Д. и Романовой Л.А [9,10]. МДА определяли в водной фазе микросом печени по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой и образования триметинового комплекса [11].

Микросомы печени получали на основе техники выделения микросомальной фракции печени [4]. Фракция СЖК печени, получаемая методом тонкослойной хроматографии, была экстрагирована хлороформ - метанолом в соотношении 2:1 и затем превращена в метиловые эфиры, с применением металлического Na [23]. МЭЖК определяли методом газовой хроматографии на колонке ДВ - 23 [20]. Режим прогрева колонки подбирался с условием оптимального режима выхода МЭЖК [22]. Маркёром ненасыщенных связей в липидах являлось определение молекулярного йода (йодное число) фракции СЖК печени и производилось вольт-амперометрическим титрованием с тиосульфитом натрия [17]. Выбор фармакологических агентов пилокарпин, атропин в решении вопроса о реципрокности мускарино-чувствительных ацетилхолиновых рецепторов (mAChRs) печени нами описывались ранее.

Статистическую обработку результатов проводили методом ANOVA с применением непараметрического дисперсионного анализа (W.H. Kruskal., W. A. Wals), парного критерия Манна - Уитни (Mann - Whitney, U-test) Количественные значения представлены в виде медианы (Me), 5 и 95 - процентилей [16].

Результаты и обсуждение

ПОЛ связан с феноменом окислительного стресса [13]. Неотьемлемой частью стресса является присутствие катехоламинов в исследуемых тканях [14]. Определяя содержание адреналина при введении пилокарпина и атропина, отмечали возникновение реципрокности (табл. 1).

Таблица 1. Адреналин и молекулярный кислород в гомогенате печени на 5-й день охлаждения и введения пилокарпина, атропина
Показатели	1-я группа - контроль 1 (интактные) (n=6)	2-я группа - контроль 2 (холод) (n=6)	3-я группа - опыт 1 (холод+пилокарпин 10мг/кг) (n=6)	4-я группа - опыт 2 (холод+атропин 1мг/кг) (n=6)
Адреналин, мкг/мл гомогегната	11,6 [10,8; 12,1]	2,5 [2,3; 2,8] Р_2-1=0,0197	2,03 [1,1; 2,2] Р_3-1=0,0001 Р_3-2=0,00394	4,35 [3,8; 4,8] Р_4-1=0,00394 Р_4-2=0,00216 Р_4-3=0,0197
Молекулярный кислород на 3-й минуте, ммоль О₂	287,2 [285,3;289,1]	277,85 [275,8;279,3] Р_2-1=0,00394	307,8 [304,2; 311,2] Р_3-1=0,00394 Р_3-2=0,0003	272,2 [270,1; 273,6] Р_4-1=0,00394 Р_4-2=0,00216 Р_4-3=0,00395
Молекулярный кислород на 30-й минуте, ммоль О₂	309,5 [307,3; 311,6]	463,35 [456,1; 471,5] Р_2-1=0,00216	428,35 [400,5; 442,5] Р_3-1=0,000297 Р_3-2=0,00394	559,0 [534,8; 581,5] Р_4-1=0,00394 Р_4-2=0,00216 Р_4-3=0,00297

В содержании молекулярного кислорода гомогената печени также отмечалось реципрокность. К 30-й минуте регистрации в электролизёре содержание молекулярного кислорода группы животных контроль 2 (холод) увеличивалась на 48,2 % (табл. 1). У животных с введением пилокарпина отмечалось снижение содержания молекулярного кислорода на 8,1 %, а у атропина - повышение на 20,6 % (табл. 1).

Определяя ДК, ГП в ОЛ печени и МДА в водной фазе микросом печени отмечали реципрокность в содержании как ДК, ГП, так и МДА микросом печени (табл. 2).

Таблица 2. Содержание диеновых коньюгатов, гидроперекисей в общих липидах, малонового диальдегида в водной фазе микросом печени после 5-дневного охлаждения экспериментальных животных и введения пилокарпина, атропина
Показатели	Диеновыеконьюгаты (нмоль/мг липида)	Гидроперекиси (нмоль/мг липида)	Малоновый диальдегид (нмоль/мл гомогената)
1-я группа, контроль 1 (интактные), n=6	223,5 [200,3;245,6]	8,26 [7,905;8,901]	2,602 [2,212;2,836]
2-я группа, контроль 2 (холод), n=6	156,1 [150,2; 174,8] Р_2-1=0,009	6,421 [6,129 ; 7,084] Р_2>-1	3,01 [2,815;3,114] Р_2>-1
3-я группа, опыт 1 (холод+пилокарпин 10 мг/кг), n=6	183,4 [174,1;189,1] Р_3-1= 0,00394 Р_3-2= 0,00216	7,307 [6,642;8,635] Р_3-1=0,109* Р_3-2=0,0104	3,746 [3,256;3,986] Р_3-1=0,00754 Р_3-2=0,00394
4-я группа, опыт 2 (холод+атропин 1 мг/кг), n=6	138,01 [126,1;147,8] Р_4-1=0,00794 Р_4-2=0,00216 Р_4-3= 0,00394	4,772 [3,076;5,863] Р_4-1=0,0003 Р_4-2=0,00394 Р_4-3=0,00876	2,262 [2,109; 2,656] Р_4-1=0,109* Р_4-2=0,00394 Р_4-3=0,0003

Примечание. Здесь и в таблицах 2, 3 при значке * значения р недостоверны.

Введение в структуру ненасыщенных компонентов липидов [6] тканей ферментативными механизмами оксигеназ молекулярного кислорода трактуемых как обязательный элемент ПОЛ.

Основой формирования оксилипинов являются жирные кислоты (ЖК) С₂₀ семейства ω - 9 [С_20:3 Δ 11,14,17 эйкозатриеновая ЖК (digomo-γ-linolenic acid, DGLA)], семейства ω-6 [C_20:4 Δ 5,8,11,14-эйкозатетраеновая ЖК (Арахи)] и семейства ω-3 [C_20:5 Δ 5,8,11,14,17 - эйкозапентаеновая ЖК (Эйкоза)] [21].

Экспериментально определено присутствие реципрокности в МЭЖК С₂₀ фракции свободных жирных кислот (СЖК) печени: в МЭЖК семейства ω - 9 [С_20:3 Δ 11, 14, 17 - эйкозотриеновой ЖК (digomo-γ-linolenic acid, DGLA)] (табл. 3) и в МЭЖК семейства ω-6 [C_20:4 Δ 5, 8, 11, 14 - эйкозотетраеновой ЖК (Арахи)] (табл. 3).

Определяя ДК и ГП во фракции СЖК печени, можно также отметить присутствие реципрокности - пилокарпин увеличивает, а атропин уменьшает выраженность перечисленных продуктов (табл. 3).

Реципрокность определена и при определении йодного числа фракции СЖК печени (табл. 3).

Таблица 3. Содержание метиловых эфиров жирных кислот С₂₀, йодного числа, диеновых коньюгатов, гидроперекисей во фракции СЖК после 5 дней охлаждения и введения пилокарпина, атропина
Показатели	1-я группа - контроль 1 (интактные) (n=6)	2-я группа - контроль 2 (холод) (n=6)	3-я группа - опыт 1 (холод+пилокарпин 10 мг/кг) (n=6)	4-я группа - опыт 2 (холод+атропин 1 мг/кг)(n=6)
МЭ cis - С_20:3 Δ 11, 14, 17 - эйкозотриеновая ЖК семейства ω-9 (digomo-г-linolenic acid, DGLA) (мкг/мл гомогената)	1946,6 [1872,4;2110,3]	480,6 [403,2; 512,2] Р_2-1=0,0197	295,3 [201,8; 350,2] P_3-1=0,0001 P_3-2=0,00394	1080,4 [900,2; 1326,7] Р_4-1=0,00394 Р_4-2=0,00216 Р_4-3=0,0197
МЭ cis - C _20:4 Δ 5, 8, 11, 14 - эйкозотетраеновой ЖК семейства ω-6 (Арахи), (мкг/мл гомогената)	59,6 [48,1; 64,7]	32,1 [30,6; 36,1] P_2-1=0,00216	53,4 [48,7; 64,6] P_3-10,240* P_3-2=0,00394	30,2 [27,7; 32,5] Р_4-1=0,00216 Р_4-2=0,0782* Р_4-3=0,00394
МЭ cis - С_20:5 Δ 5,8,11,14, 17 эйкозопентаеновой ЖК семейства ω - 3 (Эйкоза) (мкг/мл гомогената)	59,1 [56,7; 66,7]	31,8 [29,9; 32,8] P_2-1=0,00394	37,4 [36,1; 39,2] P_3-1=0,00216 P_3-2=0,00394	89,4 [78,5; 96,8] Р_4-1=0,00394 Р_4-2=0,0003 Р_4-3=0,00216
йодное число фракции СЖК липидов печени после 5 дней охлаждения и введения пилокарпина, атропина
Молекулярный йод (мкмоль J/мг липида)	59,8 [52,1; 64,1]	43,8 [40,2; 46,6] P_2-1=0,00394	9,2 [8,3; 12,3] P_3-1= 0,00216 P_3-2=0,00394	47,3 [39,8; 55,6] Р_4-1=0,0104 Р_4-2=0,423* Р_4-3=0,00394
содержание диеновых коньюгатов, гидроперекисей фракции СЖК печени после 5 дней охлаждения и введения пилокарпина, атропина
Диеновые коньюгаты (нмоль/мг липида)	19,9 [18,2; 22,2]	35,8 [32,7; 38,7] Р_2-1=0,00394	40,9 [39,2; 42,9] Р_3-1=0,0197 Р_3-2=0,00394	15,2 [13,4; 16,7] Р_4-1=0,00216 Р_4-2=0,0197 Р_4-3=0,0001
Гидроперекиси (нмоль/мг липида)	0,891 [0,796; 0,911]	1,551 [1,391; 1,613] Р_2-1=0,00394	1,769 [1,69;2,032] Р_3-1=0,00143 Р_3-2=0,00394	0,875 [0,492;1,219] Р_4-1=0,00216 Р_4-2=0,00394 Р_4-3=0,00143

Результаты экспериментов по содержанию ДК, ГП и МДА в микросомах печени свидетельствуют - введение пилокарпина и атропина на фоне охлаждения животных, приводит к появлению реципрокности (табл. 2). Следует отметить - реципрокность отмечается и в ДК, ГП фракции СЖК печени (табл.3). Сопоставляя направленность изменений в МЭЖК, семейства ω - 6 [C_20:4 Δ 5, 8, 11, 14 - эйкозотетраеновой ЖК (Арахи)] с направленностью эффектов ДК, ГП фракции СЖК печени можно предположить связь между ЖК C_20:4 Арахи и формированием ДК, ГП фракции СЖК печени при введении животным пилокарпина, атропина.

Сопоставляя данные по содержанию молекулярного йода фракции СЖК печени с содержанием МЭЖК семейства ω - 9 [С_20:3 Δ 11, 14, 17 - эйкозотриеновой ЖК (digomo-γ-linolenic acid, DGLA)] отмечаем - введение пилокарпина уменьшает йодное число и содержание МЭ С_20:3 Δ 11, 14, 17 - эйкозотриеновой ЖК (digomo-γ-linolenic acid , DGLA) фракции СЖК печени, атропин же вызывает противоположный эффект. Отмечаем также факт реципрокности.

ЖК С_20:3 Δ 11, 14, 17 - эйкозотриеновая (digomo-γ-linolenic acid , DGLA) за счёт работы оксигеназ, добавления двойных связей Δ5 десатуразой трансформируется в дальнейшем в C_20:4 Δ 5,8,11,14 - эйкозотетраеновую ЖК (Арахи) [18, 21]. Предполагаем, уменьшение пула МЭЖК cis - С_20:3 Δ 11, 14, 17 - эйкозотриеновой (digomo-γ-linolenic acid, DGLA) фракции СЖК под влиянием пилокарпина приводит к росту содержания МЭЖК cis - C _20:4 Δ 5, 8, 11, 14 - эйкозотетраеновой (Арахи) и к последующему росту содержания ДК, ГП фракции СЖК печени.

Введение животным атропина на фоне холодовой нагрузки приводит к противоположным результатам - отмечается присутствие феномена реципрокности.

Уменьшение содержания адреналина в гомогенате печени в период холодовой нагрузки и введения пилокарпина связано, предположительно, с увеличением расходования адреналина при взаимодействии с аденилатциклазным механизмами мембран гепатоцитов.

Это явление отмечается при стрессе и пилокарпин, возможно, потенциирует этот эффект. При введении же атропина отмечаем противоположные по направлению эффекты, что также свидетельствует о присутствии реципрокности.

Введение пилокарпина животным и определение молекулярного кислорода в электролизёре на 30-й минуте эксперимента связываем с увеличением потребления кислорода тканью печени и в том числе за счёт формирования процесса ПОЛ печени. Введении же животным атропина уменьшает потребление молекулярного кислорода тканью печени и возможно за счёт формирования продуктов ПОЛ печени.

Выводы

Введение животным пилокарпина, атропина на фоне 5-дневной холодовой нагрузки приводит к появлению реципрокности в диеновых коньюгатах, гидроперекисях общих липидов и малонового диальдегида в водной фазе микросом печени.
Реципрокность присутствует и при определении содержания диеновых коньюгатов, гидроперекисей, йодного числа фракции свободных жирных кислот печени.
Пилокарпин и атропин, вводимые животным в период 5-дневной холодовой нагрузки, вызывают появление реципрокности в содержании МЭЖК С_20:3 Δ 11, 14, 17 - эйкозатриеновой (digomo-γ-linolenic acid, DGLA) и МЭ ЖК C_20:4 Δ 5,8,11,14 - эйкозотетраеновой (Арахи) фракции свободных жирных кислот печени.
Пилокарпин увеличивает содержание МЭЖК C _20:4 Δ 5, 8, 11, 14 - эйкозотетраеновой (Арахи), а атропин снижает выраженность МЭ ЖК Арахи.
Пилокарпин снижает выраженность МЭЖК С _20:3 Δ 11, 14, 17 - эйкозатриеновой (digomo-γ-linolenic acid, DGLA), а атропин увеличивает её.
Холодовая нагрузка в течении 5 дней снижает содержание адреналина в ткани печени, пилокарпин в большей степени увеличивает эту тенденцию, а атропин вызывает противоположный по направлению эффект.

Холодовая нагрузка увеличивает выраженность молекулярного кислорода в ткани печени, введение пилокарпина снижает эту выраженность, а атропин увеличивает содержание молекулярного кислорода в гомогенате печени.

Литература

1. Влияние центральных холинолитиков на гипергликемию при травматическом шоке Фармакология центральных холинолитиков и других нейротропных средств. - Л. : Медицина,1969. - С. 125-154.
2. Тиханов В.И., Лосев Н.А., Доровских В.А. и др. Изменение продуктов и субстратных составляющих перекисного окисления липидов в ткани печени на фоне холодовой нагрузки и введении непрямых мускаринчуствительных и никотинчуствительных холиномиметиков // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. - 2013. - № 50. - С. 61-67.
3. Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике. - М.: Беларусь, 2002. - 463 с.
4. Карузина И.И., Арчаков А.И. Выделение микросомальной фракции печени и характеристика её окислительных систем. Современные методы в биохимии / Под ред. В.Н. Ореховича. - М.: Медицина, 1977. - С. 49-59.
5. Кейтс М. Техника липидологии. - М.: Мир, 1975. - 321 с.
6. Ушкалова В.Н. и др. Контроль перекисного окисления липидов. - Новосибирск: Изд-во Новосиб. ун-та, 1993. - 182 с.
7. Круглова О.Г. Влияние дигидрокверцетина на перекисное окисление липидов в условиях холодового воздействия: дисс. … канд. мед. наук. - Благовещенск, 2014. - 235 с.
8. Лосев Н.А. Фармакология - клинике (с учётом взаимодействия М- и Н-холинергических механизмов): актовая речь на заседании Учёного совета Института Экспериментальной Медицины. - СПб., 2007. - 44 с.
9. Метод определения гидроперекисей липидов с помощью тиоционата аммония: современные методы в биохимии / Под ред. В.Н. Ореховича. - М.: Медицина, 1977. - С. 64-66.
10. Метод определения диеновой коньюгации ненасыщенных высших жирных кислот: современные методы в биохимии / Под ред. В.Н. Ореховича. - М.: Медицина, 1977. - С. 64-66.
11. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты: современные методы в биохимии / Под ред. В.Н. Ореховича. - М.: Медицина, 1977. - С. 66-68.
12. Тиханов В.И., Лосев Н.А., Доровских В.А. и др. Окисление ацетилхолина и липидов микросом печени in vitro // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. - 2014. - № 54. - С. 75-81.
13. Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меньшикова Е.Б. Окислительный стресс: Биохимический и патофизиологический аспекты. - М.: МАИК. Наука. Интерпериодика. - 2001. - 343 с.
14. Барабой В.А. и др. Перекисное окисление и стресс. СПб.: Наука, 1992. - 148 с.
15. Поляриметрическое устройство для определения содержания молекулярного кислорода в гомогенатах исследуемых тканей и способ его применения: Патент 2348926 Рос. Федерации / авторы Тиханов, В. И., Решодько, Д. П., Варганов, О. Н.; опубликовано 10.03.2009, бюлл. № 7.
16. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. - М: МедиаСфера, 2002. - 312 с.
17. Сонгина О.А., Захаров В.А. Амперометрическое титрование. - М.: Химия, 1979. - 304 с.
18. Barre D., Holub B. The effect of borage oil consumption on the composition of individual phospholipids in human platelet // Lipids. - 1992. - Vol. 27. - P. 315-320.
19. Bligh E.C., Dyer W.J. A rapid method of total lipid extraction and purification // Biochem. Physiol. - 1959. - Vol. 37. - P. 911-917.
20. Cameron G. Separate FAME cis and trans isomers with DB - 23 // J. Lipids. - 2001. - Vol. 14, № 3. - P. 13.
21. Massey K., Nicolaou A. Lipidomics of oxidized polyunsaturated fatty acids // Free Radic. Biol. Med. - 2013. - Vol. 59. - P. 45-55.
22. Radermacher P. Method for the gas chromatographic determination of long and medium chain free fatty acids in serum // J. Clin. Chem. Clin. Biochem. - 2008. - Vol. 20, № 11. - P. 813-815.
23. Strassburg K. Quantitative profiling of oxylipins through comprehensive LC - MS analysis: application in cardiac surgery // Anal. Bioanal. Chem. - 2012. - Vol. 404. - P. 1413-1426.