2015 год № 2

Теоретическая и экспериментальная медицина

УДК. 615.275.4: 612.35] 577.352.335

В.И. Тиханов

Сопоставление перекисного окисления липидов микросом печени in vitro в присутствии пилокарпина, атропина с перекисным окислением липидов печени in vivo при введении периферического мускарино-чувствительного миметика, литика на фоне холодовой нагрузки

Амурская государственная медицинская академия, 675000, ул. Горького, 95, тел. 8-(4162)-31-90-09, e-mail: amurgma@list.ru, г. Благовещенск

Контактная информация: В.И. Тиханов , е-mail: tikchanov@yandex.ru

Резюме:

Определена реципрокность в содержании гидроперекисей (ГП), йодного числа общих липидов (ОЛ) печени in vivo при введении пилокарпина, атропина на фоне холодовой нагрузки. Оценена способность липидов микросом печени к перекисному (свободнорадикальному) окислению (ПОЛ) в присутствии пилокарпина, атропина при индуцировании неферментативных (аскорбатзависимых), ферментативных (NADP o H-зависимых) механизмов ПОЛ in vitro. Сопоставление окисления липидов печени in vitro , in vivo приводит к выводу - обьяснить разнонаправленность ПОЛ липидов печени только химическим строением фармакологических агентов пилокарпин, атропин не представляется возможным.

Ключевые слова:

продукты ПОЛ, метиловые эфиры жирных кислот, пилокарпин, атропин

V.I. Tikchanov

Comparison of lipid peroxidation of liver microsomes in vitro in the presence of pilocarpine, atropine with the contents lipid peroxidation of liver in vivo at administration of muscarinic sensitive cholinergic mimetic, litic at cold exposure

Amur State Medical Academy, Blagoveshchensk

Summary:

The author defined reciprocity in hydroperoxide, iodine value of total lipids of the liver in vivo at pilocarpine, atropine administration at cold exposure. The ability of lipid peroxidation in liver microsomes (free radical) oxidation in the presence of pilocarpine, atropine while inducing non-enzymatic (ascorbate-dependent), enzyme (NADP o H-dependent) mechanisms of lipid peroxidation in vitro was assessed. A comparison liver lipid oxidation in vitro, in vivo leads to the conclusion - it is impossible to explain omni directional liver lipid peroxidation only by the chemical structure of pharmacological agents, pilocarpine and atropine.

Key words:

products of lipid peroxidation, fatty acid methyl esters, pilocarpine, atropine

Введение

Мускарино-чувствительные холинореактивные системы - ключевое звено в работе холинергических механизмов биологической системы[7].

Возбуждение периферических мускарино-чувствительных холинорецепторов (mAChRs) ткани печени эндогенным ацетилхолином (АЦХ) увеличивает содержание диеновых коньюгатов (ДК), малонового диальдегида (МДА), но снижает содержание гидроперекисей (ГП) ткани печени. Блокада периферических mAChRs печени метацином приводит к противоположным результатам - на основании полученных фактов делается вывод о присутствии феномена реципрокности.

Для подтверждения полученных результатов целесообразно введение фармакологических агентов, имеющих отличительную особенность от АЦХ, метацина [18], но оказывающих влияние на возбуждение и блокаду периферических mAChRs, в связи с этим проводились исследования по введению животным пилокарпина, атропина на фоне холодовой нагрузки.

Цель исследования - оценить влияние прямого мускарино-чувствительного холиномиметика пилокарпин и периферического, неселективного мускарино-чувствительного холинолитика атропин на содержание продуктов ПОЛ печени, метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК) С₂₀ общих липидов печени (ОЛ), йодного числа ОЛ в период холодовой нагрузки, определить присутствие реципрокности и сопоставить полученные данные со способностью липидов микросом печени окисляться в присутствии пилокарпин, атропина in vitro.

Материалы и методы

Исследования проводились на белых, беспородных крысах-самцах массой до 160-200 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария. Выбор экспериментальных животных основывался на задачах экспериментов, связанных с феноменом стресс [12].

Охлаждение животных проводилось в климатокамере при температурном режиме - 12 °С, на протяжении 3 часов, в течение 5 дней [6].

Содержание ДК, ГП определяли во фракции ОЛ печени. ОЛ экстрагировали из гомогената печени методом Фолча [3] и Блайя - Дайлера [13]. В основе метода определения ДК и ГП лежали методы, описанные Стальной И.Д. и Романовой Л.А [8, 11]. МДА определяли в водной фазе гомогената печени по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой [10]. Метилирование жирных кислот (ЖК) проводилось в ОЛ печени методом описанным J.P. Carrelau, J.P. Dubaco [16]. Метиловые эфиры жирных кислот (МЭЖК) определяли методом газовой хроматографии на колонке ДВ - 23, для полярных соединений [14]. Режим прогрева колонки подбирался с условием оптимального режима выхода МЭЖК [19]. Фармакологический агент пилокарпин возбуждает периферические m₁AChRs и m₃AChRs [17]. В дозах до 10 мг/кг влияет и на пресинаптические m₂AChRs, снижая выход эндогенного АЦХ с пресинаптических образований [20]. Атропин - периферический, неселективный антагонист mAChRs, в дозе до 1 мг/кг блокирует работу периферических m₁AChRs, m₃AChRs и оказывает влияние на m₂AChRs, увеличивая выход АЦХ с пресинаптических образований холинергических структур тканей [18]. Перечисленные свойства фармакологических агентов позволяют использовать их в качестве агонистов и антагонистов периферических mAChRs для выяснения факта реципрокности [7].

Микросомы печени получали на основе техники выделения микросомальной фракции печени [2]. О снижении активности белка микросом печени судили, определяя активность каталазы микросом печени по цветной реакции перекиси водорода с молибдатом аммония и последующего измерения цветного комплекса при длине волны 410 нм [5]. Изменение активности белка микросом печени производилось в стекле, температура в водяной бане создавалась +80 °С [15].

Оценка содержания ненасыщенных связей в ОЛ печени производилась определением молекулярного йода (йодное число) вольт - амперометрическим титрованием с тиосульфитом натрия [9].

Статистическую обработку результатов проводили методом ANOVA с применением непараметрического дисперсионного анализа (W.H. Kruskal, W.A. Wals), парного критерия Манна - Уитни (Mann - Whitney, U-test) Количественные значения представлены в виде медианы (Me), 5 и 95 - процентилей [1].

Результаты и обсуждение

После 3часов холодовой нагрузки отмечалось увеличение содержания ДК в ОЛ печени, на фоне снижения содержания ГП и МДА [12]. После 5-го дня охлаждения животных увеличивалось содержание ТБК - активного продукта - МДА, на фоне снижения ДК и ГП (табл. 1).

Введение пилокарпина, атропина в течение 5-ти дней холодовой нагрузки приводило к реципрокности при определении ГП ОЛ печени (табл. 1). Пилокарпин снижал ГП на 17 % (табл. 1), а атропин вызывал противоположный эффект - увеличивал содержание ГП в 1,15 раза (табл. 1).

Пилокарпин увеличивал выраженность ДК, МДА на 91,6 % и 77,6 % (табл. 1), атропин снижал их до уровня групп животных контроль 2, соответственно (табл. 1).Присутствие реципрокности при оценке содержания ДК и МДА после введения животным атропина не отмечаем (табл. 1).

Таблица 1. Диеновые коньюгаты, гидроперекиси общих липидов печени, малоновый диальдегид гомогената печени после 5-дневного охлаждения экспериментальных животных и введения пилокарпина, атропина
Показатели	Диеновые коньюгаты (нмоль/мг липида)	Гидроперекиси (нмоль/мг липида)	Малоновый диальдегид (нмоль/мл гомогената)
1-я группа - контроль 1 (интактные), n=6	119,4 [105,8; 130,1]	5,525 [5,202; 5,713]	1,025 [0,903; 1,231]
2-я группа - контроль 2 (холод), n=6	102,5 [83,6; 108,3] Р_2-1=0,0168	4,65 [4,18; 4,762] Р_2-1=0,00394	1,322 [1,216; 1,572] Р_2-1=0,00648
3-я группа - опыт 1 (холод+пилокарпин 10 мг/кг), n=6	196,4 [107,7;209,8] Р_3-1=0,00394 Р_3-2=0,0003	3,979 [3,89;4,095] Р_3-1=0,0003 Р_3-2=0,00394	2,348 [2,01; 2,473] Р_3-1=0,0004 Р_3-2=0,00394
4-я группа - опыт 2 (холод+атропин) 1 мг/кг), n=6	107,8 [96,1; 128,1] Р_4-1=0,149* Р_4-2=0,0926* Р_4-3=0,0241	5,706 [5,608; 5,841] Р_4-1=0,0163 Р_4-2=0,000572 Р_4-3=0,00394	1,361 [1,306; 1,586] Р_4-1=0,00394 Р_4-2=0,297* Р_4-3=0,00216

Примечание. Здесь и в таблицах 1, 2 при значке * значения р недостоверны.

Таким образом, реципрокность отмечаем только в гидроперекисях ОЛ печени (табл. 1).

Условием распространения ПОЛ является присутствие двойных связей в ненасыщенных компонентах липидов тканей и приоритетность в этом отдаётся полиненасыщенным жирным кислотам С₂₀ [4]. Оценивая йодное число, содержание МЭЖК С₂₀ семейства ω-9, ω-6, ω-3 в ОЛ печени были получены результаты - введение пилокарпина, атропина экспериментальным животным на фоне 5 дней охлаждения приводит к появлению реципрокности только при оценке йодного числа ОЛ печени (табл. 2).

Таблица 2. Йодное число, метиловые эфиры жирных кислот С₂₀ общих липидов печени после холодовой нагрузки и введения пилокарпина, атропина
Показатели	1-я группа - контроль 1 (интактные) (n=6)	2-я группа - контроль 2 (холод) (n=6)	3-я группа - опыт 1 (холод+пилокарпин 10 мг/кг) (n=6)	4 группа - опыт 2 (холод+атропин 1 мг/кг) (n=6)
йодное число
мкмоль J/мг липида	9,315 [8,52; 12,324]	4,706 [4,118; 5,197] Р_2-1=0,00394	3,993 [3,847; 4,111] Р_3-1=0,000297 Р_3-2=0,00394	10,912 [9,117; 12,108] Р_4-1=0,149* Р_4-2=0,00394 Р_4-3=0,00216
метиловые эфиры жирных кислот С₂₀
МЭЖК, семейства ω - 9 C_20:3Δ 11, 14, 17 - эйкозатриеновая ЖК (digomo-γ-linolenic acid, DGLA) (мкг/мл гомогената)	6155,6 [5906,2; 6513,2]	5376,1 [5004,9; 5806,2 Р_2-1=0,00394	2406,1 [2201,2; 3005,5] Р_3-1=0,00394 Р_3-2=0,00216	2966,3 [2802,8; 3305,2] Р_4-1=0,00394 Р_4-2=0,00216 Р_4-3=0,179*
МЭЖК, семейства ω - 6 C_20:4 Δ 5, 8, 11, 14 - эйкозатетраеновая ЖК (Арахи) (мкг/мл гомогената)	5,021 [4,724; 5,627]	4,285 [3,807; 4,629] Р_2-1=0,00394	0,414 [0,105; 1,112] Р_3-1=0,00394 Р_3-2=0,00216	1,512 [0,107; 2,189] Р_3-1=0,00394 Р_3-2=0,00216 Р_4-3=0,004
МЭЖК, семейства ω - 3 C_20:5 Δ 5, 8, 11, 14, 17 эйкозапентаеновая ЖК (Эйкоза) (мкг/мл гомогената)	77,112 [69,568; 91,081]	115,1 [100,2; 132,16] Р_2-1=0,00394	45,151 [38,962; 58,182] Р_3-1=0,00216 Р_3-2=0,0197	3,55 [1,608; 8,904] Р_3-1=0,0197 Р_3-2=0,0001 Р_4-3=0,00216

А в МЭЖК С₂₀ семейства ω - 9, ω - 6, ω - 3 реципрокность не отмечена (табл. 2).

Полученные in vitro данные свидетельствуют - пилокарпин, атропин в инкубационной среде при индуцировании ПОЛ микросом печени неферментативными (аскорбатзависимыми) механизмами усиливает окисление липидов микросом печени (табл. 3).

Индуцирование же ПОЛ микросом печени ферментативными (NADP o H-зависимыми) механизмами приводит к противоположному эффекту - к уменьшению окисления липидов микросом печени (табл. 3).

Тепловая инактивация белковых компонентов мембран эндоплазматического ретикулума гепатоцитов в обоих механизмах индуцирования ПОЛ in vitro в присутствии пилокарпина, атропина не вызывает изменений направления окисления липидов микросом печени (табл. 3).

Таблица 3. Окислительная активность пилокарпина, атропина in vitro при индуцировании неферментативного (аскорбатзависимого), ферментативного (NADP o H-зависимого) механизмов окисления липидов микросом печени до и после тепловой обработки микросом
Показатели	Микросомы печени не подвергавшиеся тепловой обработке		Микросомы печени подвергавшиеся тепловой обработке
неферментативное (аскорбатзависимое) окисление липидов микросом печени
Мольная концентрация	пилокарпин 10^-4 М	атропин 10^-5 М	пилокарпин 10^-4 М	атропин 10^-5 М
Окислительная активность	-15,9 % [-12,8; -18,8]	-6,9 % [-4,2; -8,8]	-3,35 % [ -1,1; -4,16]	-1,3 % [-1,1; -1,4]
ферментативное (NADP o H-зависимое) окисление липидов микросом печени
Мольная концентрация	пилокарпин 10^-4М	атропин 10^-5 М	пилокарпин 10^-4 М	атропин 10^-5 М
Окислительная активность	+2,9 % [+2,1; +3,7]	+11 % [+10,8; +12,3]	+41,2 % [+40,1; +42,8]	+36,7 % [+23,6; +50,2]

Примечание. (-) - прооксидантный эффект, (+) - антиоксидантный эффект.

Окисление липидов пилокарпином, атропином in vitro, in vivo вызывают противоположные по направлению эффекты.

Эффекты окисления липидов пилокарпина in vivo по направлению совпадают с эффектами пилокарпина in vitro. Введение пилокарпина животным увеличивает содержание ДК, МДА в ткани печени (табл. 2). Введение же животным атропина вызывает противоположный эффект - снижает выраженность ДК, МДА (табл. 2), но in vitro индуцирование неферментативных (аскорбатзависимых) механизмов окисления липидов микросом печени в присутствии атропина вызывает усиление окисления липидов.

Необходимо отметить - пилокарпин in vivo уменьшает содержание гидроперекисей, а атропин увеличивает их выраженность - отмечается реципрокность (табл. 2).

Такие же факты возникают и при сопоставлении результатов экспериментов in vivo с результатами экспериментов in vitro при активации ферментативных (NADP o H-зависимых) механизмов ПОЛ.

В стекле присутствие в инкубационной среде пилокарпина, атропина приводит к уменьшению окисления липидов микросом печени (табл. 3), но in vivo пилокарпин увеличивает выраженность ДК и МДА, а атропин in vivo увеличивает содержание ГП в ОЛ печени.

Подобная противоположность в окислении липидов печени не объясняется влиянием только химических элементов, входящих в структуру фармакологических агентов пилокарпин, атропин.

Подтверждением могут служить данные по окислению липидов микросом в присутствии пилокарпина, атропина после тепловой обработки микросом печени. Тепловая инактивация активности белков мембран эндоплазматического ретикулума гепатоцитов не меняет направление в окислении пилокарпина, атропина при индуцировании механизмов ПОЛ печени in vitro, а пилокарпин, атропин in vivo меняют направление в содержании продуктов ПОЛ печени и в этом предположительно участвуют белки плазматической мембраны гепатоцитов.

Фактом, подтверждающим влияние пилокарпина, атропина на ПОЛ печени через холинорецепторный аппарат плазматической мембраны гепатоцитов, является определение содержания молекулярного йода в общих липидах печени - при определении йодного числа в общих липидах печени отмечено присутствие реципрокности.

Выводы

В присутствии пилокарпина, атропина индуцирование ПОЛ неферментативными (аскорбатзависимыми) механизмами усиливает окисление липидов микросом печени.
Активация ферментативных (NADP o H-зависимых) механизмов ПОЛ in vitro с присутствием пилокарпина, атропина в инкубационной среде уменьшает окисление липидов микросом печени.
Введение пилокарпина, атропина животным на фоне 5-дневной холодовой нагрузки вызывает противоположные по направлению эффекты окисления липидов печени при сравнении с окислением липидов печени in vitro.
Реципрокность определена в гидроперекисях общих липидов печени - пилокарпин снижает, а атропин увеличивает выраженность гидроперекисей. При определении содержания молекулярного йода в общих липидах печени отмечается появление реципрокности связанного с введением животным пилокарпина и атропина.
Тепловая инактивация белка эндоплазматического ретикулума печени не меняет направление в окислительной активности пилокарпина, атропина in vitro. Пилокарпин и атропин in vivo действуют противоположно на содержание продуктов ПОЛ печени.

Литература

1. Гланц, С. Медико-биологическая статистика.- М.: Практика, 1998. - 459 с.
2. Карузина И.И., Арчаков А.И. Выделение микросомальной фракции печени и характеристика её окислительных систем // Современные методы в биохимии / Под ред. В.Н. Ореховича. - М.: Медицина, 1977. - С. 49-59.
3. Кейтс М. Техника липидологии. - М.: Мир, 1975. - 321 с.
4. Ушкалова В.Н. и др. Контроль перекисного окисления липидов. - Новосибирск: Изд-во Новосиб. ун-та, 1993. - 182 с.
5. Королюк М.Д., Иванова, Л.И., Майорова И.Г. Метод определения активности каталазы // Лабораторное дело. - 1988. - № 1. - С. 16-18.
6. Круглова О. Г. Влияние дигидрокверцетина на перекисное окисление липидов в условиях холодового воздействия: дисс. … канд. мед. наук - Благовещенск. - 2014. - 235 с.
7. Лосев Н.А. Фармакология - клинике (с учётом взаимодействия М- и Н-холинергических механизмов). Актовая речь на заседании Учёного совета Института Экспериментальной медицины. - СПб., 2007. - 44 с.
8. Романова Л.А., Стальная И.Д. Метод определения гидроперекисей липидов с помощью тиоционата аммония // Современные методы в биохимии / Под ред. В.Н. Ореховича. - М.: Медицина, 1977. - С. 64-66.
9. Сонгина О.А., Захаров В.А. Амперометрическое титрование. - М.: Химия, 1979. - 304 с.
10. Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты // Современные методы в биохимии / Под ред. В.Н. Ореховича. - М.: Медицина, 1977. - С. 66-68.
11. Стальная И.Д. Метод определения диеновой коньюгации ненасыщенных высших жирных кислот // Современные методы в биохимии / под ред. В.Н. Ореховича. - М.: Медицина, 1977. - С. 64-66.
12. Тиханов В.И., Лосев Н.А., Доровских В.А., Решодько Д. П., Тиханов И.В., Анохина Р.А., Роговченко Е.Г. Изменение продуктов и субстратных составляющих перекисного окисления липидов в ткани печени на фоне холодовой нагрузки и введении непрямых мускаринчуствительных и никотинчуствительных холиномиметиков // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. - 2013. - № 50. - С. 61-67.
13. Bligh E.C., Dyer W.J. A rapid method of total lipid extraction and purification // Biochem. Physiol. - 1959. - Vol. 37. - P. 911-917.
14. Cameron G. Separate FAME cis and trans isomers with DB - 23 // J. Lipids. - 2001. - Vol. 14, № 3. - P. 13.
15. Capozzi V., Weidmann S., Fiocco D., Rein A., Hols P., Guzzo J., Spano G. Inactivation of а small heat shock protein affects cell morphology and memebrane fluidity in Lactobacillus plantarum WCFS1 // Research in Microbiology. - 2011. - Vol. 162, № 4. - P. 419-425.
16. Carrelau J.P., Dubaco J.P. Adaptation of macro - scale method to the microscale for fatty acid methyl tranesterification of biological lipid extracts // Journal of Chromatography. - 1978. - Vol. 151. - P. 384-390.
17. Effect of repeated administration of pilocarpine and isoproterenol on aquaporin - 5 expression in rat Salivary glands // Acta Histochem. Cytochem.-2013. - Vol. 46, № 5. - P. 187-197.
18. Gyermek L. Pharmacology of antimuscarinic agents. Library of Congress, 1998. - 501 p.
19. Radermacher P., Grote H., Susanto F., Reinaner H. A method for the gas chromatographic determination of long and medium chain free fatty acids in serum // J. Clin. Chem. Clin. Biochem. - 2008. - Vol. 20, № 11. - P. 813-815.
20. The autoinhibitory feedback control of acetylcholine release in human neocortex tissue // Brain Res. - 1992. - Vol. 572, № 1-2. - P. 64-74.