2016 год № 2

Педиатрия

УДК 612.017.1:616.921.5

Л.П. Малежик, Н.И. Карпова, М.С. Малежик, Д.Ц. Нимаева, В.Б. Цырендоржиева

Состояние системы цитокинов при полиморфизме генов TOLL-4 (Asp299Gly) и TOLL-6 (Ser249Pro) рецепторов у детей, часто болеющих острыми респираторными вирусными инфекциями

Читинская государственная медицинская академия, 672090, ул. Горького, 39а, тел. 8-(3022)-32-00-85, e-mail: macadam@mail.chita.ru, г. Чита

Контактная информация: Л.П. Малежик, e-mail: dulmanimaeva@yandex.ru

Резюме:

В работе анализируется продукция цитокинов воспаления у детей часто болеющих ОРВИ и являющихся носителями полиморфизма Toll-4 (Asp299Gly) и Toll-6 (Ser249Pro) рецепторов. Установлено, что в первые дни заболевания в крови больных детей увеличена концентрация провоспалительного цитокина ИЛ-1β , однако степень его синтеза зависит от генотипа пациента. У носителей генотипа Asp/Gly и Gly/Gly Toll-4 (Asp299Gly) рецептора продукция этого цитокина выражена в меньшей степени, чем у пациентов без полиморфных изменений в гене соответствующего рецептора. ФНО-α увеличено у всех групп больных независимо от наличия или отсутствия SNP. Концентрация противовоспалительного ИЛ-4 не отличается от группы здоровых детей, а уровень ИЛ-10 нарастает у всех обследуемых пациентов. Содержание ИЛ-1RA при ОРВИ увеличено, особенно у носителей генотипа Gly-Gly гена Asp299Gly Toll-4 рецептора. При полиморфизме в гене Toll-6 (Ser249Pro) рецептора у больных ОРВИ содержание цитокинов ИЛ-1β , ИЛ-8, ФНО-α, ИЛ-10 ниже, чем в группе больных детей без полиморфизма изучаемого рецептора. Уровень ИЛ-1RA увеличен в крови больных детей независимо от наличия или отсутствия полиморфизма сигнальных рецепторов, однако у носителей генотипа Pro/Pro концентрация антагониста рецепторов ИЛ-1 наибольшая.

Ключевые слова:

острая респираторная вирусная инфекция, TLR, полиморфизм, цитокины

L.P. Malezhik, N.I. Karpova, M.S. Malezhik, D.T. Nimaeva, V.B. Thyrendorjieva

State of cytokines at gene polymorphism TOLL-4 (ASP299GLY) AND TOLL-6 (SER249PRO) receptor among children with frequent episodes of acute respiratory viral infections

Chita State Medical Academy, Chita

Summary:

The authors analyzed production of inflammatory cytokines in children frequently ill with SARS and are carriers of polymorphism Toll-4 (Asp299Gly) and Toll-6 (Ser249Pro) receptors. It was found out that in the early days of the disease in the blood of sick children concentration of pro-inflammatory cytokine IL-1β increased, but the extent of its synthesis depends on the genotype of the patient. At genotype Asp/Gly and Gly/Gly Toll-4 (Asp299Gly) receptor of cytokine production was less pronounced than in patients without polymorphic changes in the gene corresponding receptor. TNF-α is increased in all groups of patients, regardless of the presence or absence of SNP. The concentration of anti-IL-4 does not differ from the group of healthy children, the level of IL-10 increases in all the patients tested. The content of IL-1RA with SARS increased, especially in genotype Gly-Gly gene Asp299Gly Toll-4 receptor. With polymorphism in the gene Toll-6 (Ser249Pro) receptor in patients with SARS contents of cytokines IL-1β , IL-8, TNF-α, IL-10 is lower than in patients without children of polymorphism studied receptor. The level of IL-1RA increased in blood of patients regardless of the presence or absence of polymorphism of receptor signaling, but the genotype Pro/Pro concentration of antagonist IL-1 receptor is the highest.

Key words:

acute respiratory viral infection, TLR, polymorphism, cytokines

Введение

Часто болеющие дети (ЧБД) - это термин, обозначающий группу детей с более высоким, чем у сверстников, уровнем заболеваемости острой респираторной вирусной инфекцией (ОРВИ). Максимальная заболеваемость ОРЗ среди детей отмечается в возрасте от 6 месяцев, до 6 лет и составляет более 6 эпизодов в году [3, 8]. Согласно современным представлениям основной причиной высокой восприимчивости детей к вирусной инфекции является незрелость иммунной системы [1, 2, 9] и наследственная предрасположенность к инфекционным заболеваниям [4, 5]. Генетические изменения в системе иммунитета могут быть на разных этапах иммунного ответа. В первую очередь это касается рецепторов, контактирующих с патогеном. Главную роль в распознавании патогена играют Toll-подобные рецепторы (Toll-like receptors, TLR).Они входят в состав клеточных мембран всех иммунокомпетентных клеток [6]. Полиморфизм генов Toll-рецепторов ассоциирован с рядом заболеваний. Из данных литературы известно, что SNP (Asp299Gly) гена Toll-4 ассоциирован с септическим шоком [11], c развитием атеросклероза и ишемической болезни сердца [10], сахарным диабетом [7]. SNP Ser249Pro в гене Toll-6 рецептора отмечено у больных бронхиальной астмой [12]. В более ранних работах [4] нами было установлено,что в группе часто болеющих ОРВИ детей 55,6 % имеют генетические мутации в Toll-4 (Asp299Gly) и 75 % в гене (Ser249Pro) Toll-6 рецуптора.

Лигандами для Toll-4 рецепторов является двуспиральная ДНК вирусов, а для Toll-6 рецепторов - ЛПС грамотрицательных бактерий. Контакт патоген распознающих рецепторов с лигандом запускает синтез цитокинов, которые регулируют степень иммунных реакций. Мы полагаем, что генетические нарушения в Toll-рецепторах сказываются на уровне внутриклеточной сигнализации и количестве продуцируемых цитокинов.

Цель исследования - изучить влияние полиморфизма генов Toll-4 (Asp299Gly) и Toll-6 (Ser249Pro) рецепторов на продукцию цитокинов у детей, часто болеющих острой респираторной вирусной инфекцией.

Материалы и методы

Клиническую группу составили 190 детей обоего пола в возрасте от 1 года до 3 лет, часто болеющих острыми респираторными вирусными инфекциями. Из числа обследуемых детей в 49 % был грипп, в 26 % - парагрипп, в 5 % - аденовирусная инфекция, в 4% - синцитиальный вирус. Критериями включения в исследования были: в анамнезе не менее 6 эпизодов ОРВИ, возраст пациентов от 1 до 3 лет, первые 3 дня заболевания.

В исследование не включали детей с хроническими бронхолёгочными заболеваниями (бронхиальная астма, рецидивирующий бронхит, пороки развития дыхательной системы, аллергические заболевания). Работа проводились на базе НИИ медицинской экологии. Исследуемым материалом являлась венозная кровь.

В качестве популяционного контроля использовали выборку из 76 условно здоровых детей (30 мальчиков и 46 девочек) в возрасте от 1 года до 10 лет. Выделение ДНК осуществлялось при помощи наборов "ДНК-экспресс кровь" (НПФ "Литехс", Россия, Москва). Синтез использованных в работе олигонуклеотидных праймеров выполнен НПФ "Литехс", Москва. Выявление полиморфных участков проводили методом ПЦР.

Генотипирование здоровых детей проведо в более ранних работах [4]. В настоящем исследовании анализирован уровень продукции про и противовоспалительых цитокинов при ОРВИ у 50 больных детей - носителей полиморфизма гена Toll-4 (Asp299Gly) рецептора и 75 пациентов, являющихся носителями полиморфизма гена Toll-6 (Ser249Pro) рецептора. Для сравнения результатов, полученных в группах с полиморфизмом сигнальных рецепторов, использована кровь 40 больных детей без полиморфизма генов Toll-4 рецептора и 25 пациентов без полиморфизма генов Toll-6 рецепторов.

Все больные были поделены на следующие группы: 1-я группа - здоровые дети; 2-я группа - дети с ОРВИ без полиморфизма генов Толл-4 рецептора (генотип Asp/Asp); 3-я группа - больные дети с генотипом Asp/Gly полиморфизма гена Toll-4 рецептора (Asp299Gly); 4-ю группу составили больные дети с генотипом Gly/Gly полиморфизма гена Toll-4 рецептора; 5-ю группу составили больные ОРВИ дети без полиморфизма гена Toll-6 рецептора (Ser/249Pro); 6-я группа - больные дети с генотипом Ser/Pro полиморфизма гена Toll-6 рецептора (Ser249Pro); 7-я группа - больные дети с генотипом Pro/Pro полиморфизма гена Toll-6 рецептора (Ser249Pro).

Концентрацию цитокинов ИЛ-1β , ИЛ-8, ФНО-α, ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-1RA в этих группах определяли методом твёрдофазного ИФА с использованием реагентов ТОО "Вектор-Бест" г. Новосибирск.

Статистическая обработка материала проведена методом вариационной статистики с помощью пакетов программ Microsoft Eхcel 2007, STATISTICA 6,0. Перед началом анализа вариационные ряды тестировались на нормальность с использованием критерия Шапиро - Уилка W. При нормальном распределении использовался критерий Стъюдента (t-тест). Показатели представлены в виде средних величин со стандартным отклонением (М±SD). При ненормальном распределении признака применялся критерий Манна-Уитни (U-тест).

Результаты и обсуждение

Наши исследования показали, что при полиморфизме генов (Asp299Gly) Toll-4 рецепторов синтез ИЛ-1β повышен по сравнению с группой здоровых детей. Однако у гетерозигот Asp/Gly и гомозигот Gly/Gly его концентрация ниже, чем у носителей гомозигот Asp/Asp (табл. 1).

Синтез второго противовоспалительного цитокина ФНО-α при полиморфизме гена Toll-4 рецептора у часто болеющих детей увеличен по сравнению с контролем, но в случае генотипа AspGly в меньшей степени (9,9 пкг/мл), чем при генотипе Gly/Gly (12,34 пкг/мл).

Концентрация хемокина ИЛ-8 при ОРВИ высока независимо от наличия или отсутствия полиморфизма в гене.

Синтез противовоспалительного цитокина ИЛ-4 в первые дни заболевания не меняется и полиморфные варианты гена Toll-4 на него не влияют.

Концентрация ИЛ-10 увеличивается у всех групп больных ОРВИ, особенно у носителях гетерозиготного варианта Asp/Gly.

Уровень ИЛ-1RA значительно повышен в крови больных детей по сравнению со здоровыми. При генотипе Gly/Gly концентрация IL-1RA очень высока и составляет (1984,3 пкг/мл).

Пытаясь связать генетические аномалии Toll-4 рецептора с синтезом медиаторов воспаления, мы не смогли отметить чёткой разницы в концентрации цитокинов между генотипами. Замена аллелей отразилась лишь на синтезе ИЛ-1β и ИЛ-1RA.

Таблица 1. Содержание цитокинов у пациентов с разными генотипами по полиморфизму Asp299Gly в гене Toll-4 рецепторов (медиана, 25-75 перцентили) (пкг/мл)
Цитокины	Здоровые дети (n=76) 1	Asp/Asp (n=40) 2	Asp/Gly (n=18) 3	Gly/Gly (n=32) 4
ИЛ-1β	5,4 [3,6-6,5]	17,6* [12,9-22,1]	14,6*# [9,9-20,5]	13,9*# [11,2-17,5]
ИЛ-8	7,9 [6,9-9,1]	21,8* [12,3-22,2]	20,3* [13,1-21,9]	27,7* [11-29,2]
ФНαО	2,3 [1,5-2,5]	11,3* [8,25-14,3]	9,9*# [8,0-12,1]	12,4* [11,4-15,4]
ИЛ-4	1,9 [1,2-2,5]	1,5 [0,85-2,02]	1,4 [0,9-2,09]	1,7 [1,3-2,09]
ИЛ-10	1,2 [0,7-1,8]	2,6* [1,7-3,9]	2,9* [1,5-2,8]	2,4* [1,9-4,2]
ИЛ-1RA	342,9 [263,8-465,4]	1571* [1179-1649]	1139,2*# [1050-1578]	1984,3*# [1214-2033]

Примечание. U-критерий Манна - Уитни; * - значимость различий по сравнению с контролем; # - значимость различий по сравнению с группой носителей гомозиготного Аsp/Asp генотипа.

Более четкие результаты получены при анализе цитокиновых реакций у больных - носителей полиморфизма гена Toll-6 рецептора.

У больных при всех полиморфных вариантах в гене Toll-6 рецептора уровень провоспалительного цитокина ИЛ-1β в сравнении с контрольной группой оказался значительно повышен. Особенно высока концентрация ИЛ-1β у носителей генотипа Ser/Ser (в эту группу входили больные дети без полиморфизма гена Toll-6 рецепторов (табл. 2).

Таблица 2. Содержание цитокинов у больных ОРВИ с разными генотипами по полиморфизму Ser249Pro в гене Toll-6 рецепторов (медиана, 25-75 перцентили) (пкг/мл)
Цитокины	Здоровые дети (n=76) 1	Ser/Ser (n=25) 5	Ser/Pro (n=50) 6	Pro/Pro (n=25) 7
ИЛ-1β	5,4 [3,6-6,5]	21,9* [20,6-23,3]	18,2*# [13,4-25,2]	15,4*# [10,3-21,9]
ИЛ-8	7,9 [6,9-9,1]	22,6* [19,5-27,2]	17,7*# [12,9-19,8]	16,8*# [14,4-19,9]
ФНОα	2,3 [1,5-2,5]	14,3* [11,9-16,5]	12,3*# [8,8-14,5]	11,7*# [10-14,7]
ИЛ-4	1,9 [1,2-2,5]	1,2 [0,8-1,6]	1,6 [1,4-1,9]	1,3 [0,9-1,7]
ИЛ-10	1,2 [0,7-1,8]	3,7* [2,4-4,7]	3,2*# [2,1-4,1]	2,2*# [1,1-4]
ИЛ-1RA	342,9 [263,8-465,4]	1391* [1207-1536]	1249,2*# [1053-1577]	1404,3*# [1193-1817]

Примечание. U-критерий Манна - Уитни; * - значимость различий по сравнению с контролем; # - значимость различий по сравнению с группой носителей гомозиготного Ser/Ser генотипа.

У гетерозигот Ser/Pro и гомозигот Pro/Pro продукция ИЛ-1β оказалась ниже, чем у больных без полиморфных изменений в гене Toll-6 рецептора (Ser249Pro).

Концентрация ФНОα увеличивается во всех группах больных по сравнению со здоровыми. Однако при полиморфизме Toll-6 рецептора содержание ФНО-α у носителей генотипов Ser/Pro и Pro/Pro оказалось ниже, чем у больных детей без полиморфных изменений в сигнальном рецепторе. Содержание ИЛ-8 повышено у всех групп больных особенно при генотипе Ser/Ser. Полиморфизм гена Toll-6 рецептора ограничивает продукцию этого хемокина до 17,7 пкг./мл у генотипа Ser/Pro и до 16,8 пкг/мл у генотипа Pro/Pro.

Содержание противовоспалительного цитокина ИЛ-4 в первые дни заболевания не изменяется. Концентрация ИЛ-10 повышена у всех больных по сравнению со здоровыми и особенно у гомозигот Ser/Ser. Полиморфизм гена Toll-6 рецептора несколько снижает продукцию ИЛ-10, поэтому концентрация этого цитокина у гетерозигот Ser/ Pro и гомозигот Pro/Pro ниже, чем у больных детей без полиморфизма в гене соответствующего рецептора.

Экспрессия ИЛ-1RA у больных детей повышена, особенно при генотипе Pro/Pro полиморфизма гена Toll-6 рецептора.

Таким образом, наши исследования показали, что у детей, часто болеющих острой респираторной вирусной инфекцией - носителей полиморфизма генов (Asp299Gly) Toll-4 и (Ser249Pro) Toll-6 рецепторов функциональная несостоятельность противовирусной защиты возникает на уровне синтеза цитокинов, которые являются регуляторами воспалительных реакций. Хотя общее количество про и противовоспалительных цитокинов в первые дни инфицирования увеличивается у таких детей, оно не достигает значений пациентов без полиморфных нарушений в Toll-рецепторах.

Дефект сигнальных реакций усугубляется высоким содержанием антагониста рецептора к IL-1 (IL-1RA), который ингибирует Th-1 лимфоциты клеточного иммунитета. Его высокая концентрация особенно у носителей генотипов Gly/Gly и Pro/Pro ограничивает развитие защитных противовирусных реакций, что осложняет течение воспалительного процесса.

Выводы

Полиморфизм гена Toll-4 (Asp299Gly) уменьшает синтез провоспалительного цитокина ИЛ-1-β и увеличивает концентрацию ИЛ-1RA у детей, часто болеющих ОРВИ, по сравнению с группой больных детей без носительство SNP генов Toll-4 рецептора.
У детей - носителей полиморфизма гена Toll-6 рецепторов (Ser249Pro) - при ОРВИ снижена продукция ИЛ-1β , ИЛ-8, ФНО-α, ИЛ-10 и увеличена концентрация ИЛ-1RA по сравнению с группой больных детей без полиморфизма в изучаемом рецепторе.
Исследования полиморфизма генов сигнальных рецепторов у часто болеющих ОРВИ детей позволяют выделить факторы риска и наметить пути профилактики рецидивов респираторных вирусных инфекций

Литература

1. Борисова В.Н., Булгакова В.А.,Ванеева Н.П. Иммуномодуляторы и вакцинация. - М.: 4 Мпресс, 2013. - 272 с.
2. Железникова Г.Ф. Цитокины как предикторы течения и исходы инфекций // Цитокины и воспаление. - 2009. - № 8 (1). - С. 10-17.
3. Казюкова Т.В., Коваль Г.С., Самсыгина Г.А. Часто болеющие дети: современные возможности снижения респираторной заболеваемости // Педиатрия. - 2012. - № 91 (5). - С. 42-48.
4. Карпова Н.И., Малежик Л.П., Малежик М.С. Состояние врождённого иммунитета при острой респираторной вирусной инфекции у детей-носителей полиморфизма генов Toll-4 (Asp299Gly) и Toll-6 (Ser249Pro) рецепторов // Забайкальский мед. вестник. - 2012, № 2. - С. 4-8.
5. Самсыгина Г.А., Коваль Г.С. Проблемы диагностики и лечения часто болеющих детей на современном этапе // Педиатрия. - 2009. - № 2. - С. 137-145.
6. Симбирцев А.С. Toll-белки: специфические рецепторы неспецифического иммунитета // Иммунология. - 2005. - № 6. - Р. 368-377.
7. Сульская Ю.В. Генетический полиморфизм toll-kike рецепторов 4 типа у больных сахарным диабетом 2 типа // Таврический медико-биологический вестник. - 2009. - № 3 (47). - С. 72-74.
8. Учайкин В.Ф. Эволюция патогенеза инфекционных болезней // Детские инфекции. - 2012. - № 11 (4). - С. 4-8.
9. Ярцев М.Н., Яковлева К.П. Иммунная недостаточность, часто болеющие дети и иммунокоррекция // Вопросы современной педиатрии. - 2005. - Т. 4. - С. 72-74.
10. Kiechl S., Lorenz E., Reindl V., et al. Toll-like receptor 4 polymorphisms and atherogenesis // N. Engl. J. Med. - 2002. - Vol. 347. - P. 185-192.
11. Lorenz E., Mira J., Frees K., Schwartz D. Relevance of mutations in the TLR4 receptor in patients with gram-negative septic shock // Arch. Intern. Med. - 2002. - Vol. 162. - P. 1028-1032.
12. Tantisira K., Klimecki W., Lazarus R. Toll-like receptor 6 gene (TLR6): singlenukleotide polymorphism frequencies and preliminary association with the diagnosis of astma // Genes Immun. - 2004. - Vol. 5. - P. 343-346.