2016 год № 2

Теоретическая и экспериментальная медицина

УДК 543.872:577.125:612.35:615.27

В.И. Тиханов

Изменение содержания продуктов перекисного (свободнорадикального) окисления липидов печени, вызываемого неостигмином, на фоне предварительного введения животным гексаметония и 3-часового охлаждения животных

Амурская государственная медицинская академия, 675000, ул. Горького, 95, тел.8-(4162)-319-009, e-mail: amurgma@list.ru, г. Благовещенск

Контактная информация: В.И. Тиханов , е-mail: tikchanov@yandex.ru

Резюме:

Неостигмин на фоне предварительно введённого животным гексаметония влиял на изменение содержания диеновых коньюгатов (ДК), гидроперекисей (ГП) общих липидов (ОЛ) печени, малонового диальдегида (МДА) ткани печени в период 3-часовой холодовой нагрузки. Результаты свидетельствуют о разнонаправленных эффектах, возникающих в инкубационной среде в присутствии неостигмина, гексометония при окислении липидов микросом печени in vitro, при индуцировании ферментативных (NADP·H-зависимых) и неферментативных (аскорбатзависимых) механизмов окисления липидов. Сопоставление результатов экспериментов, полученных in vivo, in vitro приводят к выводу - изменения в содержании продуктов ПОЛ не могут быть обьяснены химическими элементами, входящими в структуры фармакологических агентов неостигмин, гексометоний и не могут быть обьяснены комбинационной работой введённых фармакологических агентов с холинорецепторным аппаратом плазматической мембраны гепатоцитов.

Ключевые слова:

неостигмин, гексаметоний, ферментативное (NADP·H-зависимое) окисление липидов, неферментатвное (аскорбатзависимое) окисление липидов, диеновые коньюгаты, гидроперекиси, малоновый диальдегид

V.I. Tikchanov

Changing of the content of peroxidation products (free radical) of liver lipids caused by neostigmine on the background of preinjected hexamethonium to animals and their 3-hour cooling

Amur State Medical Academy, Blagoveshchensk

Summary:

Neostigmine at the background of pre-injected hexamethonium to animals influenced the content of diene conjugates (DC), hydroperoxides (HP) of total lipids (AL) of the liver, malondialdehyde (MDA) of liver tissue during a 3-hour cold exposure. The results showing the diverse effects caused by neostigmine, hexamethonium in oxidation of lipids of liver microsomes in vitro at inducing enzymatic (NADP·H-dependent) and non-enzymatic (ascorbate) mechanisms of oxidation are presented. The comparison of experimental results obtained in vitro and in vivo leads to the conclusion - the changes in the content of lipid peroxidation products can not be explained by chemical elements within the structure of the pharmacological agent neostigmine, hexamethonium and can not be explained by combined work of injected pharmacological agents with cholinoreceptive apparatus of the plasma membrane of hepatocytes.

Key words:

neostigmine, hexamethonium, enzymatic (NADP·H-dependent) lipid oxidation, non-fermentatic (ascorbate-dependent) lipid oxidation, diene conjugates, hydroperoxide, malondialdehyde

Введение

Накопление эндогенного ацетилхолина (АЦХ) в ткани печени вызывает изменения содержания продуктов перекисного (свободнорадикального) окисления липидов (ПОЛ) печени после 3-часовой холодовой нагрузки экспериментальных животных [11]. Полученные в эксперименте данные позволяют продолжить работу с фармакологическими агентами, работающими в области холинергических структур плазматической мембраны гепатоцитов.

Так, данные по введению животным периферического, неселективного никотино-чувствительного холинолитика гескаметоний на фоне 3 часов холодовой нагрузки свидетельствуют об изменениях в содержании продуктов ПОЛ печени.

Сопоставление полученных данных с результатами окисления липидов микросом печени, произведенных in vitro в присутствии гексаметония, позволяет сделать выводы - изменение содержания продуктов ПОЛ печени при введении животным гексаметония не объясняются химическим элементами, входящими в структуру данного фармакологического агента.

Поэтому анализ и сопоставление полученных данных объясняет дальнейшее проведение экспериментов по введению на фоне гексаметония фармакологического агента, способного антихолинэстеразными механизмами накапливая эндогенный АЦХ возбуждать периферические мускарино-чувствительные ацетилхолиновые рецепторы (mAChRs) G-белков плазматической мембраны клеток [17].

Цель исследования - оценить эффекты неостигмина, вводимого на фоне гексаметония на содержание продуктов ПОЛ печени после 3-часовой холодовой нагрузки создаваемой животным. Определить влияние присутствующих в инкубационной среде неостигмина, гексаметония на окисление липидов микросом печени in vitro и сопоставить результаты окисления липидов печени, полученные как in vivo, так in vitro.

Материалы и методы

Исследования проводили на 115 беспородных крысах - самцах массой от 150 до 200 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария с соблюдением режима тепла, кормления, без ограничения доступа к питьевой воде. Выбор животных для проводимых экспериментов базировался на задачах экспериментов, связанных с феноменом стресс [16]. Охлаждение животных проводилось в климатокамере при температурном режиме - 12 °С, на протяжении 3 часов [3]. В выборе фармакологического агента накапливающего антихолинэстеразными механизмами эндогенный АЦХ, остановились на неостигмине - присутствие четырёхвалентного атома азота в триметиламмонийной соcтавляющей неостигмина позволяет оказывать периферические эффекты накопленного эндогенного АЦХ [5].

Критерием накопления АЦХ в тканях служила обильная саливация и единичные сокращения поперечно-полосатой мускулатуры животных [1]. Мольная концентрация неостигмина, в инкубационной среде 10^-4 М соответствует дозе неостигмина вводимого животным - 0,2 мг/кг [11, 12].

Гексаметоний блокирует работу периферических никотино-чувствительных реактивных структур лиганд проводящих ионных каналов плазматической мембраны клетки [15], выбранный фармакологический агент использовался в более ранних исследованиях по предложенной тематике. Молярная концентрация гексаметония в инкубационной среде создавалась согласно дозам гексаметония, работающего in vivo.

Общие липиды экстрагировали из гомогената печени методом Фолча [2, 14]. В основе метода определения диеновых коньюгатов (ДК) и гидроперекисей (ГП) общих липидов (ОЛ) лежали методы, описанные Стальной И.Д. и Романовой Л.А. [8, 10].

Малоновый диальдегид (МДА) определяли в водной фазе, полученной из гомогената печени по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой и образования триметинового комплекса при спектре поглощения 532 нм [9].

Определение окислительной активности (ОА) неостигмина и гексаметония in vitro оценивалось по способности уменьшать или увеличивать результаты неферментативного (аскорбатзависимого) и ферментативного (NADP·H-зависимого) ПОЛ инкубационной среды в присутствии микросом печени, и выражалось в процентах [12].

Статистическую обработку результатов проводили методом ANOVA с применением непараметрического дисперсионного анализа по W.H. Kruskal, W.A. Wals, парного критерия Манна - Уитни (Mann - Whitney, U-test). Количественные значения представлены в виде медианы (Me), 5 и 95 - процентилей [7].

Результаты и обсуждение

Холодовая нагрузка в течение 3 часов увеличивает содержание ДК ОЛ печени, но при этом отмечается снижение ГП ОЛ печени и МДА гомогената печени (табл. 1). Введение животным неостигмина на фоне гексаметония (0,2 мг/кг; 2 мг/кг) приводит к увеличению содержания ДК ОЛ печени не только по отношению к группе животных контроль₂, но и при сравнении этого показателя между группами опыт₁ и опыт₂ (табл. 1).

Введение неостигмина на фоне гексаметония (20 мг/кг) не приводит к росту ДК ОЛ печени (табл. 1).

В группе животных контроль₂ (холод), отмечается снижение ГП ОЛ печени. Введение животным неостигмина на фоне гексаметония (0,2 мг/кг; 2 мг/кг; 20 мг/кг) вызывает достоверное увеличение ГП ОЛ печени (табл. 1).

Неостигмин на фоне гексометония (0,2 мг/кг; 2 мг/кг, 20 мг/кг) в период 3-часовой холодовой нагрузки приводит к более выраженному снижению содержания МДА, определяемого в гомогенате печени при сравнении с данными животных группы контроль₂ (табл. 1).

Таблица 1. Содержание диеновых коньюгатов, гидроперекисей общих липидов печени, малонового диальдегида гомогената печени после 3-часового охлаждения экспериментальных животных и введения неостигмина на фоне гексаметония
Показатели	Диеновые коньюгаты (нмоль/мг липида)	Гидроперекиси (нмоль/мг липида)	Малоновый диальдегид (нмоль/мл гомогената)
1-я группа, контроль₁ (интактные), n=6	137,9 [128,7÷149,2]	4,4 [4,0÷4,6]	1,7 [1,4÷1,9]
2-я группа, контроль₂ (холод), n=6	187,8 [166,0÷198,1], Р_{2 -1}=0,004	3,7 [3,1÷3,9], Р_{2 -1}=0,00394	1,2 [1,1÷1,4], Р_2-1 =0,00394
3-я группа, опыт₁ (холод+гексаметоний 0,2 мг/кг+неостигмин 0,2 мг/кг), n=6	209,5 [199,5÷214,8], Р_{3 -2}=0,0161	9,825 [8,4÷10,9], Р_{3 -2}=0,00045	0,79 [0,7÷0,83], Р_{3 -2}=0,0256
4-я группа, опыт₂ (холод+гексаметоний 2 мг/кг+неостигмин 0,2 мг/кг), n=6	222,4 [200,7÷258,2], Р_4-2=0,00212, Р_4-3=0,00394	9,018 [8,6÷9,3] Р_4-2=0,005 Р_4-3=0,2*	0,81 [0,7÷0,84] Р_4-2 = 0,0131 Р_4-3 = 0,0781*
5-я группа, опыт₃ (холод+гексаметоний 20 мг/кг+неостигмин 0,2 мг/кг), n=6	187,8 [163,4÷192,3], Р_5-2=0,688*, Р_5-3=0,004, Р_5-4=0,001	4,4 [3,6÷5,8], Р_5-2=0,006, Р_5-3=0,004, Р_5-4=0,00394	0,8 [0,73÷0,94], Р_5-2=0,00394, Р_5-3=0,0618, Р_5-4=0,0731

Примечание. Здесь, в таблице 1, при значке * значения р недостоверны.

Результаты, полученные при введении животным неостигмина на фоне гексаметония в период 3-часовой холодовой нагрузки ставят вопрос о возможном влиянии химических элементов, входящих в структуры молекул неостигмина, гексаметония на продукты ПОЛ печени.

Для ответа на этот вопрос проведен ряд экспериментов in vitro с индуцированием ПОЛ микросом печени неферментативными и ферментативными механизмами в присутствии неостигмина и гексаметония.

При индуцировании неферментативных механизмов ПОЛ in vitro отмечается возникновение слабого антиоксидантного эффекта и по мере уменьшения молярной концентрации гексаметония в инкубационной среде этот эффект возрастает (табл. 2) .

Таблица 2. Неферментативное (аскорбатзависимое) ПОЛ микросом с содержанием неостигмина и гексаметония в инкубационной среде (МДА - нмоль /мг белка)
Показатели	Окислительная активность комбинации неостигмина, гексаметония
Неостигмин 10^-4 М + гексаметоний 10^-4 М	+0,106 % [0,093÷0,130]
Неостигмин 10^-4 М + гексаметоний 10^-5 М	+0,44 % [0,38÷0,53]
Неостигмин 10^-4 М + гексаметоний 10^-6 М	+0,92 % [0,88÷0,103]

Примечание. Здесь, в таблице 2 и далее (+) - ослабление окисления липидов, (-) - усиление окисления липидов.

Индуцирование же ферментативных механизмов ПОЛ в присутствии неостигмина и гексаметония приводит к увеличению окисления липидов микросом печени, отмечается возрастание эффекта окисления липидов по мере уменьшения молярной концентрации гексаметония в инкубационной среде (табл. 3).

Таблица 3. Ферментативное (NADP·H-зависимое) ПОЛ микросом с содержанием неостигмина и гексаметония в инкубационной среде (МДА - нмоль/мг белка)
Показатели	Окислительная активность комбинации неостигмина, гексаметония
Неостигмин 10^-4 М + гексаметоний10^-4 М	-2,8 % [1,13÷2,93]
Неостигмин 10^-4 М + гексаметоний 10^-5 М	-3,4 % [2,98÷3,53]
Неостигмин 10^-4 М + гексаметоний 10^-6 М	-4,1 % [3,88÷4,4]

Сопоставляя результаты экспериментов ПОЛ печени, полученных in vivo и in vitro нужно напомнить - введение животным неостигмина на фоне гексаметония приводит к росту содержания ДК ОЛ, ГП ОЛ печени, индуцирование ферментативных механизмов ПОЛ in vitro в присутствии неостигмина и гексаметонием также увеличивает окисление липидов микросом печени. Высказываются предположения о том, что увеличение окисления липидов печени плазматической мембраны гепатоцитов происходит за счёт химических элементов, входящих в структуры неостигмина, гексаметония, но участие периферических mAChRs в окислении липидов печени не установлено.

Предполагая, что при холодовой нагрузке доминируют неферментативные механизмы ПОЛ печени и, сопоставляя результаты экспериментов, полученные in vivo с результатами окисления липидов микросом печени in vitro при индуцировании неферментативных механизмов ПОЛ, невозможно объяснить изменения в содержании продуктов ПОЛ комбинацией только химических элементов входящих в структуры молекул неостигмина и гексометония, но представляется возможным предположить, что это результат работы перечисленных фармакологических агентов с mAChRs плазматической мембраны гепатоцитов.

Выводы

Неостигмин, вводимый животным на фоне гексаметония и 3-часовой холодовой нагрузки приводит к увеличению содержания диеновой коньюгации, гидроперекисей общих липидов печени, но снижает содержание ТБК-активного продукта - малонового диальдегида.
Присутствие неостигмина при индуцировании ферментативных (NADP·H-зависимых) механизмов ПОЛ в микросомах печени in vitro усиливает окисление липидов, активация же неферментативных (аскорбатзависимых) механизмов ПОЛ уменьшает окисление липидов микросом печени.
Влияние возбуждения периферических mAChRs G-белков плазматической мембраны клеток печени эндогенным ацетилхолином на содержание продуктов ПОЛ печени остаётся не выясненным.

Литература

1. Аничков С.В. Избирательное действие медиаторных средств. - Медицина, 1974. - 291 с.
2. Кейтс М. Техника липидологии. - М.: Мир,1975. - 321 с.
3. Круглова О.Г. Влияние дигидрокверцетина на перекисное окисление липидов в условиях холодового воздействия: дисс. … канд. мед. наук. - Благовещенск. - 2014. - 235с.
4. Лосев Н. А. Фармакология - клинике (с учётом взаимодействия М- и Н-холинергических механизмов) / Актовая речь на заседании Учёного совета Института Экспериментальной медицины. - СПб., 2007. - 44 с.
5. Машковский М.Д. Лекарственные средства. - 16-е изд., перераб., испр. и доп. - М.: Новая волна, 2012. - 1216 с.
6. Моргунова Т.В., Лазарева Д.Н. Влияние лекарственных средств на свободнорадикальное окисление // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2000. - Т. 63, № 1. - С. 71-75.
7. Реброва, О. Ю. Статистический анализ медицинских данных. - М: Медиа-Сфера, 2002. - 312 с.
8. Романова Л.А., Стальная И.Д. Метод определения гидроперекисей липидов с помощью тиоционата аммония // Современные методы в биохимии / под ред. В.Н. Ореховича. - М.: Медицина, 1977. - С. 64-66.
9. Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты // Современные методы в биохимии / Под ред. В.Н. Ореховича. - М.: Медицина, 1977. - С. 66-68.
10. Стальная И.Д. Метод определения диеновой коньюгации ненасыщенных высших жирных кислот // Современные методы в биохимии / Под ред. В.Н. Ореховича. - М.: Медицина,1977. - С. 64-66.
11. Тиханов В.И., Лосев Н.А., Доровских В.А., Решодько Д.П., Тиханов И.В., Анохина Р.А., Роговченко Е.Г. Изменение продуктов и субстратных составляющих перекисного окисления липидов в ткани печени на фоне холодовой нагрузки и введении непрямых мускаринчуствительных и никотинчуствительных холиномиметиков // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. - 2013. - Вып. 50. - P. 61-67.
12. Тиханов В.И., Лосев Н.А., Доровских В.А., Решодько Д.П., Тиханов И.В., Анохина Р.А., Роговченко Е.Г. Сравнение окислительной активности прозерина при кратковременной холодовой нагрузке in vivo и in vitro // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. - 2013. - № 49. - P. 77-81.
13. Bligh E.C., Dyer W.J. A rapid method of total lipid extraction and purification // Biochem. Physiol. - 1959. - Vol. 37. - P. 911-917.
14. Furusava N., Nakamura M., Morita Y., Okazaki K. Simple and rapid extraction method of total egg lipids for determining organochlorine pesticides in the egg // Journal of Chromatography A. - 1999. -Vol. 830. - P. 473-476.
15. Hurst R., Rollema H., Bertrand D. Nicotinic acethylcholine receptors from basic science to therapeutics // Pharmacol. Ther. - 2013. - Vol. 137. - Р. 22-54.
16. Selye H. A syndromу produced by divers nocions agents // Nature. - 1936. - Vol. 3479. - P. 32-40.
17. Xie X.Q., Wang L., Lin H., et al. Chemogenomics knowed debased polypharmacology analyses of drug, abuse related G-protein coupled receptors and their ligands // Front. Pharmacol. - 2014. - Vol. 5. - 3 p.
18. Laszlo Gyermek. Pharmacology of antimuscarinic agents. - Library of congress. - 1998. - 501 p.