2016 год № 3

Оториноларингология

УДК 616.28-008-07

Е.В. Байке

Генетический полиморфизм гена IL-10 (G1082A) и его влияние на содержание интерлейкина-10 в крови у больных хроническим гнойным средним отитом

Читинская государственная медицинская академия, 672090, ул. Горького, 39а, тел. 8-(3022)-35-43-24, факс 8-(3022)-32-30-58, е-mail: pochta@chitgma.ru, г. Чита

Контактная информация: Е.В. Байке , e-mail: elenabayke@yandex.ru

Резюме:

В ходе иммуногенетического исследования проведено изучение влияния полиморфизма гена IL-10 (G1082А) на содержание интерлейкина-10 в крови больных с разным течением хронического гнойного среднего отита. Установлено, что у больных аллель А гена IL-10 (G1082А) встречается чаще в 2 раза, чем среди здоровых лиц. Отмечается высокая частота встречаемости аллеля А в участке G1082А промотора гена ИЛ-10 с преобладанием гомозиготного варианта А/А, особенно при кариозно-деструктивном течении заболевания. Присутствие А-аллели у больных хроническим гнойным средним отитом сопровождается уменьшением продукции IL-10 при вариантах генотипов G/А и А/А вариантах носительства полиморфизма гена IL-10 (G1082А).

Ключевые слова:

хронический гнойный средний отит, полиморфизм генов интерлейкина-10 (G1082А

E.V. Bayke

The genetic polymorphism of gene IL-10 (G1082А) and its influence on the maintenance of interleukin-10 in blood of patients with the chronic purulent otitis media

Chita state medical academy, Chita

Summary:

During immunogenetic studies we have researched the influence of polymorphism of IL-10 gene (G1082A) on the content of IL-10 in the blood of patients with chronic purulent otitis media. We found that patients with chronic purulent otitis media allele A gene IL-10 (G1082A) occurs 2 times more frequently than in healthy individuals. Spotted an almost equal frequency of alleles A in the sector G1082A gene promoter of IL-10 with a predominance of homozygous variant A/A, especially in patients with caries-destructive course of the disease. The presence of A-allele in patients with chronic purulent otitis media accompanied by a decrease in the production of IL-10 heterozygous G/A and homozygous A/A variants carrier gene polymorphism IL-10 (G1082A).

Key words:

chronic purulent otitis media, gene polymorphisms of interleukin-10 (G1082A

Введение

Направление и активность иммунного ответа зависят от концентрации и соотношения продукции целого каскада цитокинов, сопровождающих развитие любого воспалительного ответа [3, 4]. Функционирование цитокиновой сети при любой патологии зависит от многих причин, в число которых входят индивидуальные различия в продукции медиаторов воспаления, обусловленных генетическими особенностями. Полиморфизм генов цитокинов является существенным фактором предрасположенности к инфицированию, развитию заболевания и длительному, осложненному его течению [1, 2, 7]. Известно, что заболеваемость хроническим гнойным средним отитом в РФ остается высокой - до 39,2 на 1 000 населения и с частотой 0,61 на 100 000 населения осложняется внутричерепной патологией, развивающейся вследствие кариозно-деструктивных процессов, протекающих в среднем ухе [5, 8, 10].

Целью исследования явилось изучение влияния полиморфизма гена IL-10 (G1082A) на содержание интерлейкина-10 в крови больных хроническим гнойным средним отитом при тимпаноантральной и туботимпанальной формах.

Материалы и методы

В исследование были включены 299 пациентов ЛОР-отделения ККБ г. Читы. В работе с обследуемыми лицами соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинкской Декларацией Всемирной Медицинской Ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki (1964, 2000-поправки) и правилами клинической практики в Российской Федерации, утвержденными приказом Минздравсоцразвития РФ от 19.06.2003 г. № 266.

Пациенты распределялись по характеру течения заболевания на 2 группы. Первую составили 146 пациентов, страдающих туботимпанальной формой ХГСО (мезотимпанит), с мукозным течением в среднем ухе (наличие центральной перфорации, отсутствие деструктивных изменений на компьютерных томограммах, стойкая ремиссия или обострения не более 2 раз в год). Вторая группа представлена 153 больными тимпаноантральной формой хронического отита (эпитимпанит), у которых жалобы, анамнестические данные, отомикроскопия, рентгенограммы и дальнейшее оперативное лечение подтверждают кариозно-деструктивные процессы в среднем ухе. Частота обострений "злокачественной" формы заболевания составила в среднем 4 раза в год. В качестве контрольной группы обследовано 183 здоровых жителя Забайкальского края. Группы сопоставимы по полу и возрасту.

Всем больным были выполнены стандартные общеклинические исследования. Анализу подвергали геномную ДНК человека, выделенную из лейкоцитов цельной крови с помощью реагента "ДНК-экспресс - кровь" (ООО НТП "Литех", г. Москва). С образцом выделенной ДНК параллельно проводили две реакции амплификации с двумя парами аллель-специфичных праймеров в режиме реального времени (PCR-rt), гель-электрофорезом в ультрафиолетовом свете. Результаты анализа позволяли дать три типа заключений: нормальная гомозигота, гетерозигота, мутантная гомозигота.

Для определения концентрации IL-10 использовали наборы реагентов ООО "Вектор Бест" (Новосибирск). Измерение уровня цитокинов проводили методом твёрдофазного ИФА.

Полученные данные обработаны с помощью пакетов программ BIOSTAT, STATISTICA 6,0 (StatSoftInc., США). Для определения частот аллельных вариантов генов применялся закон Харди-Вайнберга. Для анализа ассоциации маркёров исследуемых генов с заболеванием сравнивали частоты аллелей и генотипов в группах больных, используя критерий χ². Данные о концентрации цитокинов оценивали непараметрическими методами с определением медианы (М_е), интерквартильной широты (25 %-75 %), с использованием критерия Вилкоксона. Статистически значимыми считали различия при р<0,05.

Результаты исследования и обсуждение.

Гены интерлейкинов обладают чрезвычайно высокой степенью полиморфизма, при этом количество вариабельных участков может быть множественным. Анализ промоторного участка гена IL-10 (G1082A), оказывающего влияние на фенотипическое проявление заболевания, показал, что в развитии хронического гнойного процесса в среднем ухе имеются генетически детерминированные предпосылки (табл. 1).

Таблица 1. Распределение частоты полиморфизма генов у пациентов с разными формами хроническог гнойного среднего отита
ПолиморфизмIL-10(G1082A)	Генотипы			Аллели
ПолиморфизмIL-10(G1082A)	G/G	G/A	A/A	G	A
Контроль, n=183 (%)	87 (47,5 %)	69 (37,7 %)	27 (14,8 %)	243 (66 %)	123 (34 %)
Мезотимпанит, n=146 (%)	34 (23,3 %)	97 (66,4 %)	15 (10,3 %)	165 (56,5 %)	127 (43,5 %)
Эпитимпанит, n=153 (%)	25 (16,4 %)	38 (24,8 %)	90 (58,8 %)	88 (28,8 %)	218 (71,2 %)
рχ^{2 1-2} OR₁	9,77*	8,72*	1,14	1,59 OR₁ =1,52, CI 95 % (1,11-2,09)	3,01 OR₁ =0,66, CI 95 % (0,48-0,90)
рχ^{2 1-3} OR₂	18,90*	3,32	34,38*	33,39* OR₂ =4,89, CI 95 % (3,52-6,80)	30,65* OR₂ = 6,20, CI 95 % (0,15-0,28)
рχ^{2 2-3} OR₃	1,53	20,01*	38,69*	19,20* OR₃=3,22, CI 95 % (2,29-4,52)	12,80* OR₃=0,31, CI 95 % (0,22-0,44)

Примечание. рχ^{2 1-2}- сравнение между контрольной группой и мезотимпанита; рχ^{2 1-3}- сравнение между контрольной группой и эпитимпанита; рχ^{2 2-3}- сравнение между группами мезотимпанита и эпитимпанита; OR₁ - сравнение между контрольной группой и мезотимпанита; OR₂ - сравнение между контрольной группой и эпитимпанита; OR 3 - сравнение между группами мезотимпанита и эпитимпанита; * - различия статистически значимы (р<0,05).

В последнее время описаны аллельные полиморфизмы не только структурных генов, оказывающих влияние на структуру и функциональные свойства цитокинов, но также некодируемых участков - интронов, промотора, мутации которых изменяют экспрессию и количество кодируемого белка [9]. Исходя из этого, нами было изучено влияние анализируемого полиморфизма G1082A генаIL-10 на уровень продукции кодируемого цитокина (табл. 2, 3).

Таблица 2. Содержание IL-10 в сыворотке крови больных хроническим гнойным средним отитом в зависимости от генотипа полиморфизма гена IL-10 (G1082A), пкг/мл (М_е, 25-75 %)
Течение заболевания	Сроки наблюдения
Течение заболевания	1-е сутки	10-е сутки
генотип G/G
Контроль	1,4 (0,8-1,7)
ХГСО	119,3 (82,2-154,1) р₁<0,001	63,7 (45,2-83,9) р₁<0,001, р₂<0,001
Генотип G/A
Контроль	1,2 (0,7-1,3)
ХГСО	51,72 (38,5-72,2) р₁<0,001, р₃<0,001	26,5 (14,9-47,9) р₁<0,001, р₂<0,001, р₃<0,001
Генотип А/A
Контроль	0,9 (0,4-1,2)
ХГСО	30,64 (15,1 - 49,3) р₁<0,001, р₃<0,001, р₄<0,001	21,7 (12,5 - 34,6) р₁<0,001, р₂<0,001, р₃<0,001, р₄<0,001

Примечание. р₁ - статистическая значимость различий с контролем; р₂ - статистическая значимость различий с 1-ми сутками наблюдения; р₃ - статистическая значимость различий по сравнению с генотипом G/G; р₄ - статистическая значимость различий по сравнению с генотипом G/А.

Таблица 3. Содержание IL-10 в сыворотке крови больных с разным течением ХГСО в зависимости от генотипа полиморфизма гена IL-10 (G1082A), пкг/мл (М_е, 25-75 %)
Течение ХГСО	Сроки наблюдения
Течение ХГСО	1-е сутки	10-е сутки
генотип G/G
Контроль	1,4 (0,8-1,7)
Туботимпанальная форма	83,1 (66,5-98,4) р₁<0,001	31,4 (20,1-42,7) р₁<0,001, р₂<0,001
Эпитимпаноантральная форма	46,3 (33,9-62,7) р₁<0,001	14,3 (8,7-18) р₁<0,001, р₂<0,001
Генотип G/A
Контроль	1,2 (0,7-1,3)
Туботимпанальная форма	29,6 (19,8-41,3) р₁<0,001, р₃<0,001	16,2 (13,1-19,3) р₁<0,001, р₂<0,001, р₃<0,001
Эпитимпаноантральная форма	22,12 (12,8-30,1) р₁<0,001, р₃<0,001,	8,7 (6,2-10,5) р₁<0,001, р₂<0,001, р₃<0,001
Генотип А/A
Контроль	0,9 (0,4-1,2)
Туботимпанальная форма	16,5 (13,2-19,6) р₁<0,001, р₃<0,001, р₄<0,001	10,7 (6,2-14,3) р₁<0,001, р₂<0,001, р₃<0,001, р₄<0,001
Эпитимпаноантральная форма	14,4 (8,7-17,9) р₁<0,001, р₃<0,001, р₄<0,001	8,0 (6,3-10,5) р₁<0,001, р₂<0,001, р₃<0,001, р₄<0,001

Выявлено, что уже в 1-е сутки наблюдения у пациентов с ХГСО, независимо от генотипа, повышается концентрация интерлейкина-10 по сравнению с группой контроля (р<0,001). Однако, у больных-носителей разных генотипов уровень цитокинов в крови различный. Так, при "доброкачественном" течении хронического среднего отита у лиц с генотипом G/G концентрация IL-10 существенно выше группы контроля в 80 раз (р<0,001). У носителей гетерозиготного варианта G/A содержание IL-10 составило 29,6 (19,8-41,3) пкг/мл, а у обладателей гомозиготного А/А - 16,5 (13,2-19,6) пкг/мл.

Интересно то, что у лиц, страдающих кариозно-деструктивными процессами в среднем ухе (эпитимпаноантральной формой ХГСО) зарегистрированы высокие уровни противовоспалительного цитокина в крови по сравнению с группой контроля, однако это практически в 2 раза ниже концентрации исследуемого медиатора воспаления больных с мукозным течением хронического среднего отита.

На 10-е сутки консервативной терапии лиц 1-й группы и комплексного лечения (проводились оперативные вмешательства) второй группы у всех пациентов наблюдалось снижение уровня IL-10 в крови. Наличие аллели G существенно изменило концентрацию интерлейкина-10 в крови больных. Среди лиц, страдающих ХГСО, носителей гетерозиготы G/А его содержание при мезотимпаните составило 16,2 (13,1-19,3) пкг/мл, а при эпитимпаните - 8,7 (6,2-10,5) пкг/мл. Максимальные концентрации IL-10 выявлялись среди лиц гомозиготных носителей G/G. При туботимпанальной форме ХГСО она составила 31,4 (20,1-42,7) пкг/мл, а при эпитимпанальной - 14,3 (8,7-18) пкг/мл.

Следовательно, полученные результаты демонстрируют влияние аллельного полиморфизма G1082A гена IL-10 на уровень противовоспалительного цитокина 10 в крови больных хроническим гнойным средним отитом.

Учитывая, что мутация G1082A занимает промоторную область гена IL-10, можно утверждать, что именно она сказывается на скорости транскрипции и трансляции кодируемого белка IL-10, продуцируемого активированными моноцитами и Т-лимфацитами. Известно, что IL-10 - это противовоспалительный цитокин, оказывающий тормозящее действие на Т-хелперы 1-го клона, снижая таким образом, синтез провоспалительных цитокинов [6]. В случае низкого уровня IL-10 поддерживается высокая концентрация провоспалительных цитокинов, что также приводит к неблагоприятному течению и исходу заболевания.

Таким образом, снижение продукции IL-10 у носителей аллели А полиморфизма гена IL-10 (G1082A)является важным звеном патогенеза кариозно-деструктивного процесса в среднем ухе.

Выводы

У больных хроническим гнойным средним отитом аллель А гена IL-10 (G1082A) встречается в 3 раза чаще, чем среди здоровых лиц.
Распределение генотипов среди лиц, страдающих хроническим гнойным средним отитом, характеризуется превалированием вариантов G/A и A/Aгена IL-10 (G1082A).
Присутствие аллеля А сопровождается снижением продукции IL-10 у больных хроническим средним отитом при гетерозиготном G/А и гомозиготном А/А вариантах носительства полиморфизма гена IL-10 (G1082A).

Литература

1. Доржиева Н.Э., Витковский Ю.А., СудаковаЛ.Р. Полиморфизм гена IL-10 (C819T) у больных с воспалительными заболеваниями пародонта в забайкальском крае // Забайкальский медицинский вестник [электронный ресурс]. - 2011. - № 1. - С. 44-48. - Режим доступа: http://medacadem.chita.ru/zmv.
2. Емельянова А.Н. Полиморфизм генов цитокинов ИЛ-2 (T330G), ИЛ-10 (С819Т) и ИЛ-10 (G1082A) при хроническом вирусном гепатите С // Молекулярная медицина. - 2013. - № 3 - С. 46-48.
3. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С. Цитокины. - СПб.: ООО "Издательство Фолиант", 2008. - 552 с.
4. Коненков В.И., Смольникова М.В. Полиморфизм промоторных регионов генов IL-4 и 10 и фактора некроза опухолей α у ВИЧ-инфицированных // Бюллетень экспериментальной биологии медицины. - 2002. - Т. 133, № 4. - С. 449-451.
5. КрюковА.И., Гаров Е.В., Сидорина Н.Г. и др.Санирующая хирургия при хроническом гнойном среднем отите с холестеатомой // Вестник оториноларингологии. - 2011. - № 1. - С.62-65.
6. Кузник Б.И., Цыбиков Н.Н., Витковский Ю.А. Единая клеточно-гуморальная система защиты организма // Тромбоз, гемостаз и реология. - 2005. -№2(22). - С. 3-14.
7. Ризванова Ф.Ф., Пикуза О.И., Файзуллина Р.А. и др. Генетическая диагностика: полиморфизм генов цитокинов // Практическая медицина. - 2010. - № 6 (45). - С. 41-43.
8. Свистушкин В.М. Отогенные интракраниальные осложнения в ЛОР-практике в настоящее время // Материалы XI Российского конгресса оториноларингологов "Наука и практика в оториноларингологии". - М.: 2012. - С. 115-117.
9. Сенников С.В. Методы определения цитокинов // Цитокины и воспаление. - 2005. - Т. 4, № 1. - С. 22-27.
10. Янов Ю.К., Кривопалов А.А., Корнеенков А.А. и др. Клинические особенности отогенных внутричерепных осложнений на современном этапе // Вестник оториноларингологии. - 2015. - № 5. -С. 23-29.