2017 год № 4

Резюме:

Ключевые слова:

Summary:

Key words:

Введение

Успехи молекулярной биологии последнего десятилетия XX века: открытие генетического кода, изучение структуры и роли нуклеиновых кислот, как хранителей генетической информации живой материи, позволили существенно расширить возможности диагностики инфекционных заболеваний. Переломным этапом стало открытие К. Мюллисом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в 1983 г. Применявшиеся ранее методы диагностики микроорганизмов (микроскопия, иммунофлюоресценция, выделение микроорганизмов на культуре тканей и бактериальных средах) были трудоемкими, дорогостоящими, длительными, субъективными, низкочувствительными. Метод ПЦР оказался методом выбора в большинстве ситуаций при использовании в практическом здравоохранении.

Оценка роли внутриутробных инфекций, вызванных персистирующими и условно-патогенными микроорганизмами, в формировании патологии беременности, плода и новорожденного, совершенствование алгоритма тестирования - одна из наиболее острых проблем перинатологии.

Цель работы: представить результаты применения метода ПЦР для диагностики репродуктивно значимых инфекций в системе мать - плацента - плод.

Материалы и методы

Проведена детекция ДНК цитомегаловируса (CMV), вируса простого герпеса (HSV), хламидии трахоматис (Chlamydia trachomatis) и генитальных микоплазм (Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma urealyticum) в генитальных мазках 2 000 женщин репродуктивного возраста г. Хабаровска.

Сыворотки крови 505 женщин репродуктивного возраста обследованы на антитела к CMV, HSV, С. trachomatis.

Методом ПЦР исследовали биопсийный и аутопсийный материал, в том числе образцы хориальной и плодовой тканей при ранних спонтанных выкидышах (n=135), пробы, полученные при аспирационных биопсиях эндометрия вне беременности у женщин со спонтанными абортами в анамнезе (n=32), пробы, полученные при добровольных медицинских абортах у условно здоровых женщин (n=70), образцы плаценты 33 женщин, беременность которых протекала с плацентарной недостаточностью и 32 женщин с физиологически протекающей беременностью. Методом ПЦР проведена этиологическая верификация летальных инфекций у 20 погибших маловесных детей.

В аутопсийном и биопсийном материале определяли геном следующих возбудителей: C. trachomatis, M. hominis, M. genitalium, U. urealyticum,CMV, HSV, Herpes human virus 4 type & 6 type, Enteroviruses, Rubella, Parvovirus B19, Listeria monocytogenes, Streptococcus pneumoniae, S. pyogenes, S. agalactiae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Haemophilus influenzae, Candida albicans, Aspergillus fumigatus. Работу осуществляли с помощью наборов реагентов "АмплиСенс" (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) и ООО "Лаборатория Изоген" (г. Москва).

Методом ПЦР в реальном времени исследовали состояние биоценоза генитального тракта у женщин с преждевременным излитием околоплодных вод (n=29), с физиологически развивающейся беременностью (n=38), у женщин в период прегравидарной подготовки (n=35).

Результаты и обсуждение

С помощью генодиагностики и серологических методов исследования определена инфицированность женщин репродуктивного возраста г. Хабаровска персистирующими перинатально значимыми инфекциями и установлен риск вертикальной передачи. В первую очередь, исследования касались вирусов семейства Herpesviridae, что связано с их убиквитарностью, способностью к персистенции и активации на фоне сниженного иммунитета, возможностью тяжелых инвалидизирующих последствий у детей, перенесших внутриутробную герпетическую или цитомегаловирусную (ЦМВИ) инфекции (поражения ЦНС после герпетических энцефалитов, нейросенсорная глухота и задержка в развитии у детей с врожденной ЦМВИ) [6, 16].

Частота выявления ДНК вируса простого герпеса (HSV) в генитальных мазках у беременных и небеременных женщин составляет соответственно 0,8 % и 4,8 %, ДНК цитомегаловируса (CMV) - 2,6-3,2 % [1, 8]. При бессимтомном выявлении ДНК HSV в генитальных мазках у беременной риск поражения плода составляет 0,05 %, но 70 % детей с неонатальным герпесом рождаются от матерей без клинических симптомов генитального герпеса [6, 18]. По мнению [21] тест на ДНК CMV в моче или цервикальном секрете - может быть или не быть обнаружен и не коррелирует ни с клиническим течением, ни с риском внутриутробной передачи, ни с тяжестью состояния новорожденного.

Частота выявления IgG к HSV и CMV у женщин репродуктивного возраста г. Хабаровска составляет 97,2-97,6 % соответственно [8]. То есть только 2-3 % беременных женщин в г. Хабаровске не инфицированы герпес-вирусами, и только у части из этих женщин во время беременности может произойти первичное заражение с высоким риском трансплацентарной передачи. По данным литературы риск передачи CMV при первичной инфекции составляет 40-50 %, HSV - до 70 % [16, 17]. У остальных 97-98 % женщин г. Хабаровска передача инфекции плоду может происходить в результате рецидива или суперинфекции, при этом риск вертикальной передачи снижается для CMV до 0,2-2,0 %, для HSV - до 2,0-3,0 % [6, 16, 17]. Инфицирована ли женщина, имеется ли у нее первичная, рецидивирующая или латентная инфекция, какова должна быть тактика ведения беременных женщин с выявленными маркерами герпес-инфекций - это устанавливается на основе результатов ПЦР и выявления серологических маркеров [13, 14].

Частота неонатального герпеса в США 1:3000 беременностей [19], в Японии 1:14000 [16]. Частота врожденной ЦМВИ в США и Европе составляет 0,5-2 % беременностей [20, 23]. Достоверных данных по РФ нет. В Хабаровске ежегодно на учет по беременности становится около 9 000 женщин. Экстраполируя показатели других стран, можно предположить, что детей с неонатальным герпесом может родиться в г. Хабаровске от 0 до 3 в год, с врожденной ЦМВИ - до 90.

Частота выявления ДНК Chlamydia trachomatis у беременных и небеременных женщин г. Хабаровска составила 6,4-6,7 % [8]. Проследили исходы беременности у 20 женщин с выявленными маркерами хламидийной инфекции (ДНК C.trachomatis, анти-хлами IgA), не получивших адекватное лечение. Беременность завершилась спонтанным выкидышем у 3 из них, у 17 женщин - определена плацентарная недостаточность, внутриутробная гипоксия плода. УЗ-исследование установило преждевременное созревание плаценты, кисты, дефекты ворсинчатого хориона, аномалии прикрепления. У новорожденных в 80,0 % случаев диагностировали церебральную ишемию гипоксического генеза, поздний восстановительный период. Таким образом, подтверждены ранее известные положения о том, что антенатальное заражение C.trachomatis плаценты восходящим путем из инфицированных половых путей матери приводит к воспалительным процессам в плаценте и, как следствие, - к гипоксии, задержке развития плода, плацентарной недостаточности и самопроизвольному прерыванию беременности, церебральной ишемии новорожденных [8, 11].

Частота выявления ДНК микоплазм в генитальных мазках у беременных и небеременных женщин г. Хабаровска составила: Ureaplasma urealyticum - 44,8-47,9 % Mycoplasma hominis - 17,0-37,0 %, Mycoplasma genitalium - 2,4-2,8 % [1, 8]. Несмотря на широкое распространение микоплазм, их истинное патогенетическое значение в развитии осложнений беременности не установлено. Одни исследователи [7, 21, 22] связывают микоплазмоз с бесплодием, мертворождениями, преждевременными родами, рождением детей с гипотрофиями и малым весом. Другие считают, что носительство генитальных микоплазм не оказывает существенного влияния на частоту развития преждевременных родов, рождения недоношенных детей. Количественная оценка концентрации микоплазм - общепринятая граница 104 ГЭ/мл - не выявляет связи с развитием патологии беременности, родов и неонатального периода. Поэтому скрининг на наличие данных микроорганизмов и назначение специфической антибактериальной терапии во время беременности является неоправданным [2]. Благодаря разработке нами совместно с сотрудниками ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора новой технологии - "Способ выявления возбудителей ВУИ в аутопсийном материале" [10] стало возможно определять широкий круг репродуктивно значимых инфекций в аутопсийном и биопсийном материале при потерях плода и новорожденного, в том числе микоплазм, определение их роли в развитии репродуктивных патологий.

Исследование образцов хориальной и плодовой тканей при ранних спонтанных выкидышах (1-я группа), проб, полученных при аспирационных биопсиях эндометрия вне беременности у женщин с невынашиванием в анамнезе (2-я группа), проб, полученных при добровольных медицинских абортах у условно здоровых женщин (3-я группа) показало наличие в 1-й, 2-й и 3-й группах соответственно ДНК U. urealyticum в 11,9 %, 18,8 % и 1,4 % случаев, M. hominis - в 7,4 %, 12,5 %, 2,6 %, M. genitalium - 6,0 %, 6,3 %, 1,4 %, С. Trachomatis - 5,2 %, 3,1 %, 1,4 %, CMV - 4,4 %, 4,4 % и 2,9 %. Частота выявления микоплазм в образцах тканей в 1-й и 2-й группах была достоверно выше, чем в 3-й [8]. Наиболее часто определяли микроорганизмы в образцах биопсий эндометрия. С инфицированием эндометрия может быть связана хронизация невынашивания беременности.

В плацентах женщин, беременность которых протекала с плацентарной недостаточностью, ДНК репродуктивно значимых инфекций обнаружены в 72,7 % случаев. Чаще всего выявляли микоплазмы: U.urealyticum - 55,9 %, M. hominis - 14,7 %, попадающие в плаценту восходящим путем из инфицированных генитальных путей матери. Следующие по частоте выявления - герпес-вирусы, персистирующие в лейкоцитах крови, - CMV - 6,1 %, Herpes human virus 6 type - 6,1 %, 4 type - 14,0 %. ДНК С. trachomatis определили в 3,3 % случаев. У женщин с физиологически развивающейся беременностью обнаружили только U.urealyticum - в 22,5 % случаев. В группе женщин с инфицированными плацентами достоверно чаще, чем у женщин с неинфицированными плацентами происходило несвоевременное излитие околоплодных вод, декомпенсация хронической плацентарной недостаточности, рождение недоношенных детей с низкой и очень низкой массой тела и другими признаками неонатальной инфекции [9, 12]. В случаях выявления возбудителей ВУИ вирусологические находки были подтверждены наличием морфологических признаков инфекционно-воспалительных процессов [3, 4].

Методом ПЦР проведена этиологическая верификация летальных инфекций у маловесных детей, умерших в ранний неонатальный период (n=5) и в постнатальный период (n=15). Аутопсийный материал (пробы органов и плаценты) от детей, умерших в ранний неонатальный период (до 7 дней жизни), был инфицирован возбудителями инфекций, колонизирующих генитальный тракт женщины (U.urealyticum, M. hominis). При гибели детей в более поздний период (с 2 недель до 2 месяцев жизни) в аутопсийном материале обнаружены моноинфекции и ассоциации микроорганизмов, таких как микоплазмы, герпес-вирусы, респираторные вирусы, кокковая, бациллярная микрофлора, грибы. Источником инфицирования при этом является как микрофлора респираторного и генитального тракта матери, так и окружающая среда [5, 15]. Микоплазмы определяются в сочетании с другими микроорганизмами, это затрудняет оценку роли микоплазм в формировании патологических процессов.

Выводы

1. Частота выявления ДНК HSV в генитальных мазках беременных женщин г. Хабаровска составляет 0,8 %, CMV - 2,6 %, C. trachomatis - 6,4 %, U. urealyticum - 44,8 %, M. Hominis - 17,0 %, M. Genitalium - 2,4 %.
2. В аутопсийном материале от спонтанных выкидышей, в пробах биопсий эндометрия женщин с привычным невынашиванием, в плацентах женщин, беременность которых протекала с плацентарной недостаточностью, обнаруживались генитальные микоплазмы (U. urealyticum и M. hominis), часто в сочетании с другими микроорганизмами. В материале контрольных групп микоплазмы также выявлялись, но значительно реже. Изучение вероятности трансформации колонизации микоплазмами в инфекционный процесс в зависимости от массивности инфицирования и характера дефицитных состояний у матери - задача наших будущих исследований.
3. Следующие по частоте выявления в пробах плацент при беременности, протекающей с плацентарной недостаточностью, аутопсийном материале от погибших плодов и детей - герпес-вирусы, персистирующие в лейкоцитах крови (CMV, Herpes human virus 6 и 4 type). Хламидии, листерии, стрептококки и др. патогены выявляются в единичных случаях.
4. В практическом плане применение метода ПЦР для диагностики возбудителей ВУИ в аутопсийном материале дает возможность выявлять один из этиологических факторов "потерь плода" и использовать результаты диагностики для реабилитации матерей перед будущей беременностью. Цель этих исследований - профилактика инвалидизирующих болезней у детей.

Литература

1. 1. Власова М.А., Островская О.В., Супрун С.В. и соавт. Выявляемость возбудителей перинатально-значимых инфекций у беременных Приамурья // Дальневосточный журнал инфекционной патологии. - 2011. - № 19. - С. 67-70.
2. 2. Иванова Т.А., Гущин А.Е., Белова А.В. и соавт. Ассоциация генитальных микоплазм (Ureaplasma parvum, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis) с развитием осложнений в родах и раннем неонатальном периоде // Молекулярная диагностика. - 2010: Cборник трудов VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. - М., 2010. - Т. III. - С. 335-338
3. 3. Ивахнишина Н.М., Кожарская О.В., Островская О.В. и соавт. Прогностическое значение инфицирования плаценты для оценки состояния новорожденного // Уральский научный вестник. - Казахстан. - 2014. - № 3 (82). - С. 20-29.
4. 4. Ивахнишина Н.М., Кожарская О.В., Островская О.В. и соавт. Инфицированность плаценты при невынашивании беременности // Бюллетень физиологии и патологии дыхания". - 2015. - № 54. - С. 92-96.
5. 5. Ивахнишина Н.М., Островская О.В., Кожарская О.В. и соавт. Диагностика возбудителей внутриутробных и постнатальных инфекций в аутопсийном материале погибших маловесных детей // Дальневосточный медицинский журнал. - 2015. - № 4. - С. 44-47.
6. 6. Кицак В.Я. Вирусные инфекции беременных: патология плода и новорожденных: информационно-методическое пособие. - Кольцово, 2004. - 70 с.
7. 7. Малкова Е.М., Гришаева О.Н. Диагностика внутриутробных инфекций у новорожденных детей методом полимеразной цепной реакции. - Томск: Кольцово, 2000. - 38 с.
8. 8. Островская О.В. Внутриутробные инфекции, клинико-морфологическая оценка современной специфической диагностики: автореф. дис. … д-ра мед. наук. - Хабаровск, 2009. - 44 с.
9. 9. Островская О.В., Власова М.А., Ивахнишина Н.М., Наговицына Е.Б. Связь генитальных микоплазм с невынашиванием беременности // "Science in the modern information society VI": Мат. VI международной научно-практической конференции. - USA. - 2010. - Т. 3 - P. 31-34. - http:// isociety. science-publish.ru.
10. 10. Островская О.В., Ивахнишина Н.М., Власова М.А. и соавт. Способ выявления возбудителей внутриутробных инфекций в аутопсийном материале от погибших плодов и новорожденных: методические рекомендации. - Хабаровск, 2012. - 23 с.
11. 11. Островская О.В., Супрун С.В., Власова М.А. и соавт. Значение антенатального скрининга беременных женщин на наличие маркеров активизации герпес-инфекций и хламидиоза // Дальневосточный медицинский журнал. - 2013. - № 3. - С. 43-46.
12. 12. Островская О.В., Кожарская О.В., Ивахнишина Н.М. и соавт. Ассоциация между инфицированностью плаценты и рождением маловесных детей // Молекулярная диагностика. - 2014 / Сб. трудов VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. - М., 2014. - Т. 1. - С. 239-240.
13. 13. Островская О.В., Наговицына Е.Б., Ивахнишина Н.М., Власова М.А Врожденные и перинатальные герпес-вирусные инфекции. - Хабаровск: Изд. дом "Арно", 2014. - 124 с.
14. 14. Островская О.В., Владимирова Н.Ю., Наговицына Е.Б. и соавт. Алгоритм лабораторной диагностики и терапии герпес-вирусных инфекций у беременных женщин и новорожденных детей: методические рекомендации для врачей. - Хабаровск, 2017. - 32 с.
15. 15. Островская О.В., Ивахнишина Н.М., Кожарская О.В. и соавт. Диагностика летальных инфекций у маловесных детей // Молекулярная диагностика - 2017: Сб. трудов IX Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. - М., 2017. - Т. I. - С. 400-4001.
16. 16. Фризе К., Кахель В. Инфекционные заболевания беременных и новорожденных: монография, пер. с нем. - М.: Медицина, 2003. - 424 с.
17. 17. Bonalumi S., Trapanese A., Santamaria A., et al. Cetomegalovirus infection in pregnancy: review of literature // J. Prenat Med. - 2011. - Vol. 5, № 1. - P. 1-8.
18. 18. Brown Z.A., Selke S., Zeh J., et al. The acquisition of HSV during pregnancy // N. Engl. J. Med. - 1997. - Vol. 337. - P. 509-515.
19. 19. Cherpes T.L., Matthews D.B., Maryak S.A. Neonatal herpes simplex virus infection // Clin. Obstet. Gynecol. - 2012. - Vol. 55 (4). - P. 938-944.
20. 20. Kimberlin D.W., Jill Batey M.D. Guidance in Management of Asymptomatic Neonates Born to Women with Active Genital Herpes lesions // J. Am. Academy Pediatrics. - 2014. - P. 635-646.
21. 21. Newell M.I., McInture J. Congenital and perinatal infection: prevention, diagnosis and treatment // Cambridge University Press. - 2000. - 439 p.
22. 22. Romero R., Garite T.J. Twenty percent of very preterm neonates (23-32 weeks of gestation) are born with bacteremia caused by genital Mycoplasmas // Am. J. Obstet Gynecol. - 2008. - Vol. 198 (1). - P. 1-3/3.
23. 23. Wang C., Zhang X., Bialek S., Cannon M.J. Attribution of congenital cytomegalovirus infection primary versus non-primary maternal infection // Clinical Infectious Diseases. - 2011. - Vol. 52 (2). - P. 1-13.