2018 год № 2

Теоретическая и экспериментальная медицина

УДК 617.58:616.13-004.6-074:616.15

Ю.С. Винник, С.С. Дунаевская, В.А. Арапова, С.В. Якимов

Исследование активности хемилюминесцентной реакции нейтрофилов крови у крыс при моделировании перитонита

Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого, 660077, ул. Партизана Железняка, 1, г. Красноярск

Контактная информация: С.С. Дунаевская, e-mail: Vikto-potapenk@yandex.ru

Резюме:

Проведено изучение активности хемилюминесцентной реакции нейтрофилов крови при моделируемом перитоните у крыс. Экспериментальная работа выполнена на половозрелых крысах линии "Wistar". Животные были разделены на две группы: 1 - контрольная группа (n=20); 2 - экспериментальная группа (n=20), с моделированным перитонитом. Для регистрации скорости образования активных форм кислорода в крови животных использовался метод люминол и люцигенин-зависимой хемилюминесценции. Полученные результаты обработаны статистически. По результатам проведенного экспериментального исследования на модели перитонита у крыс зарегистрировано увеличение активности хемилюминесцентной реакции, возрастала площадь под кривой и удлинялось время выхода на пик реакции. Таким образом, происходит активация процессов кислород-зависимого метаболизма нейтрофилов крови у крыс, что характеризует процессы, как гипероксический тип генерации активных форм кислорода.

Ключевые слова:

перитонит, хемилюминесцентная реакция, моделирование перитонита у крыс

Yu.S. Vinnik, S.S. Dunaevskaya, V.A. Arapova, S.V. Yakimov

Study of activity of chemiluminescent reaction of neutrophils of blood in rats in the model of peritonitis

Krasnoyarsk State Medical University, named after prof. V. F. Voyno-Yasenetsky of the Russian Ministry of Health, Krasnoyarsk

Summary:

Study of activity of chemiluminescent reaction of neutrophils of blood in the modeled peritonitis in rats was carried out. The experimental work was performed on pubertal rats of "Wistar" breed. Animals were divided into two groups: 1 - control group (n=20); 2 - the experimental group (n=20), with the simulated peritonitis. To register the velocity of oxygen active firms formation in blood of animals the method of luminol and a lucigenin-dependent chemiluminescence was used. The received results were processed statistically. The results of the conducted pilot research on peritonitis model in rats, increase in activity of chemiluminescent reaction was observed, the area under a curve increased and time of an exit to reaction peak was extended. Thus, there was an activation of processes oxygen - dependent metabolism of neutrophils of blood in rats that characterized the processes as hyperoxic type of regeneration of oxygen active forms.

Key words:

peritonitis, chemiluminescent reaction, model of peritonitis in rats

Введение

Актуальность проблемы перитонита не ослабевает в связи с сохраняющимися высокими цифрами летальности, которая при тяжелых формах достигает 90 %. Основной причиной летальных исходов является развитие абдоминального сепсиса, который формируется на фоне системной воспалительной реакции и прогрессировании полиорганной недостаточности. Патогенез развития воспалительного ответа основан на активации медиаторов воспалительной реакции, прогрессировании свободнорадикальных процессов и эндотелиальной недостаточности [3, 6, 8].

Поэтому актуальным направлением является изучение активности гранулоцитарных клеток в процессах формирования и прогрессирования воспалительной реакции [1, 7]. Особое место занимает метод хемилюминесценции, позволяющий оценить функциональную активность клеток крови. Оценивая тип генерации активных форм кислорода, продуцируемых гранулоцитарно-макрофагальными клетками, можно прогнозировать тяжесть воспалительного процесса [2, 5, 9].

Цель исследования - изучение активности хемилюминесцентной реакции нейтрофилов крови при моделируемом перитоните у крыс.

Материалы и методы

Экспериментальная работа выполнена на половозрелых крысах лини "Wistar", средняя масса составила 200,0±45,0 г. Исследование выполнено согласно принципам Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 1986).

Работа выполнялась на здоровых животных, без внешних признаков заболеваний, предварительно подвергшихся карантинному режиму. Крысы содержались в виварии в стандартных условиях. Животные были разделены на две группы: 1 - контрольная группа (n=20); 2 - экспериментальная группа (n=20).

В контрольную группу вошли животные без моделирования перитонита, в экспериментальной группе всем животным проводилось моделирование перитонита. Моделирование перитонита осуществляли следующим образом: производили обработку операционного поля, предварительно проведя сухое бритье передней брюшной стенки. Животным после проведения лапаротомии, выводили из брюшной полости купол слепой кишки. Некроз слепой кишки осуществляли путем наложения лигатуры, одновременно вводили 2 мл свежей отфильтрованной каловой аутовзвеси в просвет слепой кишки. Взвесь получали путем смешивания 0,5 мл стерильного изотонического раствора NaCl и 0,25 граммов кала интактных животных, полученного путем фильтрации ее через двойной слой марли. Вводили аутовзвесь не позднее чем через 10 минут после ее приготовления. Введенное количество каловой взвеси являлось достаточным для развития гнойного разлитого перитонита. Операционную рану послойно ушивали.

Оперативное вмешательство и все манипуляции проводились животным под общим обезболиванием. Эвтаназию осуществляли путем передозировки средств для наркоза в соответствии с п. 8 "Правила гуманного обращения с лабораторными животными". В качестве средства для наркоза использовали хлоралгидрат 300 мг/кг внутрибрюшинно.

Для регистрации скорости образования АФК использовался метод люминол и люцигенин-зависимой хемилюминесценции, основанный на фиксации потока фотонов, образующихся при окислении химического активатора реакции - люминола или люцигенина.

Выделение нейтрофилов проводили одномоментным центрифугированием в градиенте плотности фиколл-верографина. Остаточные эритроциты удаляли с помощью осмотического шока. Жизнеспособность суспензии нейтрофилов в тесте с трепановым синим была не менее 97 %.

Для проведения хемилюминесцентного анализа в кювету вносили 100 мкл суспензии исследуемых клеток (1×10⁶ кл./мл), 200 мкл 2,2×10^-4 М люминола (Sigma) или люцигенина (Sigma-Aldrich) в растворе Хенкса (рН=7,4). Для индукции фагоцитоза добавляли 50 мкл взвеси частиц монодисперсного латекса (2,3 мкм, 5×108 частиц/мл, ВНИИСК, С.-Петербург), опсонизированных белками сыворотки крови человека. Образование АФК регистрировали в течение 90 мин. при температуре +37 °С на аппаратурно-программном комплексе "Хемилюминометр CL-3604-ПЭВМ" [4].

Анализировали следующие показатели: S - площадь под кривой, I _max-интенсивность реакции, T_max-время достижения I_max.

Полученные результаты обрабатывались с помощью стандартных статистических программ Microsoft Office Excel 2007. Для всех показателей определяли средние значения (М), а также стандартное отклонение (s). Для оценки степени достоверности различий между группами использовали простой критерий Стьюдента (t). Различия между показателями считали достоверными при p<0,05.

Результаты и обсуждение

Величина максимальной активности хемилюминесцентной реакции клеток крови (I_max, имп./с) у крыс с моделированным перитонитом при спонтанной реакции статистически достоверно не отличалась между контрольной и экспериментальной группами. Данный показатель при активации реакции люминолом превышал уровень в экспериментальной группе в сравнении с контрольной в 6,7 раза. Значение площади под кривой при спонтанной реакции достоверно не отличался в группах. Однако, при активированной реакции показатель возрос в 8,2 раза в экспериментальной группе животных. Время выхода на пик реакции увеличивался в группе животных с экспериментальным перитонитом: при спонтанной реакции в 1,6 раза и при активированной в 11,2 раза (таблица).

Таблица. Значения параметров хемилюминесцентной реакции гранулацитарно-макрофагальными клетками крови у крыс
№ серии	Активатор реакции	I_max, имп. сек.	S, млн. имп.	Т_max, мин.
Контрольная группа	люминол акт.	190,13±17,23	0,69±0,03	6,71±2,51
	люминол спон.	232,63±89,56	0,84±0,25	54,58±4,82
	люцигенин акт.	278,24±102,41	1,03±0,34	19,34±6,74
	люцигенин спонт.	158,34±31,12	0,54±0,14	18,23±1,25
Экспериментальная группа	люминол акт.	1276,87±69,23*	5,67±0,23*	75,01±9,50*
	люминол спон.	239,30±98,08	1,06±0,34	87,27±4,34*
	люцигенин акт.	479,18±25,55*	2,36±0,66*	55,31±15,70*
	люцигенин спонт.	379,48±255,09*	1,25±0,02*	9,15±1,24*

Примечание. * - р<0,05 между показателями клинических групп от группы контроля.

Анализируя хемилюминесцентную реакцию с люцигениновым зондом выявлены следующие тенденции: возрастание I_max при спонтанной реакции в 2,3 раза и при активированной в 1,7 раза при развитии экспериментального перитонита. Площадь под кривой хемилюминесцентной реакции увеличилась при спонтанной и активированной реакции в 2,3 раза. Время выхода на пик удлинилось при активированной реакции в 2,9 раза и укоротилось при спонтанной в 1,9 раза.

Увеличение максимальной активности хемилюминесцентной реакции клеток крови у крыс с моделируемым перитонитом позволяет судить о возрастание активности клеток, участвующих в неспецифической защите организма в условиях воспалительной реакции [9]. Возрастание площади под кривой на фоне удлинения времени выхода на пик реакции свидетельствует о недостаточной активности антиоксидантной системы.

При развитии перитонита происходит активация процессов кислород-зависимого метаболизма нейтрофилов крови у крыс, что характеризует процессы, как гипероксический тип генерации активных форм кислорода.

Литература

1. Багненко С.Ф., Чепур С.В., Селезнев А.Б., Родионов Г.Г., Мирзабаев А.Т., Великий К.Ф. Внутрикишечное использование субстратного антигипоксанта цитофлавина при экспериментальном моделировании распространенного перитонита // Скорая медицинская помощь. - 2011. - Т. 12, № 2. - С. 12.
2. Бакаева З.В., Самонина Г.Е., Умарова Б.А., Копылова Г.Н., Гончарова Е.Л., Багликова К.Е. Исследование противовоспалительных свойств глкопролинов на экспериментальной модели острого перитонита у крыс // Цитокины и воспаление. - 2008. - № 2. Т. 7. - С. 28-32.
3. Винник Ю.С., Якимов С.В., Арапова В.А., Дунаевская С.С. Современные методы санации брюшной полости при распространенном перитоните // Современные проблемы науки и образования. - 2015. - № 6. - С. 1-6.
4. Макарская Г.В., Тарских С.В., Турицына Е.Г. Люминол- и люцигенинзависимая хемилюминесценция клеток цельной крови кур в постнатальном онтогенезе // Российская сельскохозяйственная наука. - 2011. - № 3. - С. 46-48.
5. Осочук С.С., Коневалова Н.Ю. Изменения липидной композиции микросом печени крыс при экспериментальном перитоните // Новости хирургии. - 2006. - № 2, Т. 14. - С. 2-6.
6. Рожнова О.М. Особенности функциональной активности нейтрофилов у крыс с экспериментальным асептическим перитонитом на фоне мерказолил индуцированного гипотиреоза // Современные наукоемкие технологии. - 2009. - № 12. - С. 64-65.
7. Русин В.И., Зиматкин С.М., Смотрин С.М. Гистологическая оценка состояния брюшины крыс при экспериментальном перитоните и его лечении с применением фотодинамической терапии // Журнал Гродненского государственного медицинского университета. - 2011. - № 3 (35). - С. 21-24.
8. Срубилин Д.В., Еникеев Д.А., Мышкин В.А., Исаков И.Д., Исакова А.В., Каширина Е.П. Роль нитроксидергической системы в регуляции окислительного стресса в печени у крыс с экспериментальным перитонитом // Фундаментальные исследования. - 2014. - № 10-4. - С. 724-731.
9. Цейликман В.Э., Козочкин Д.А., Плеханова Е.В., Савочкина А.Ю., Смирнова Т.Г., Мисюкевич Н.Д. Изменение функциональной активности нейтрофилов перитониального экссудата у крыс при различном моделировании перитонита // Вестник Челябинского государственного университета. - 2013. - № 7 (289). - С. 11.