2018 год № 4

Теоретическая и экспериментальная медицина

УДК 616.36:577.151]:618.3-06]-092.9

С.П. Мозолева¹, А.П. Надеев¹, ², С.В. Позднякова¹, Т.А. Агеева¹

Экспрессия матриксной металлопротеиназы-9 и тканевого ингибитора матриксных металлопротеиназ-1 в печени у новорожденных мышей линий СВА и С57В1/6, перенесших внутриутробное кандидозное инфицирование

¹Новосибирский государственный медицинский университет, 630091, Красный проспект, 52, тел. 8-(383)-222-32-04, е-mail: rector@ngmu.ru;
²НИИ экспериментальной и клинической медицины при Федеральном исследовательском центре "Фундаментальная и трансляционная медицина", 630117, ул. Тимакова, 2, тел. 8-(383)-333-65-37, г. Новосибирск

Контактная информация: А.П. Надеев, e-mail: nadeevngma@mail.ru

Резюме:

Цель исследования - изучить экспрессию ММР-9, TIMP-1 и их соотношения в гепатоцитах и непаренхиматозных клетках печени у новорожденных мышей двух оппозитных линий СВА и С57В1/6, после перенесенного внутриутробного кандидозного инфицирования. Экспрессии ММР-9 и ТМР 1 и их соотношение в печени у новорожденных мышей линий СВА и С57В1/6, перенесших внутриутробно кандидозное инфицирование, генетически детерминированы. У мышей линий СВА, перенесших внутриутробно кандидозное инфицирование, суммарные показатели экспрессии имели более высокие значения по сравнению с мышами линии C57Bl/6. У новорожденных мышей линии C57Bl/6, перенесших внутриутробно кандидозное инфицирование, выявлена слабая экспрессия ММР-9 и более высокий уровень экспрессии TIMP-1 в клетках очагов гемопоэза, синусоидальных клетках, что обусловило соотношение ММР-9 / TIMP менее 1. У новорожденных мышей линии CBA, перенесших внутриутробно кандидозное инфицирование, отмечена выраженная экспрессия ММР-9 и более низкий уровень экспрессии TIMP-1 в клетках очагов гемопоэза, синусоидальных клеток, что обусловило соотношение ММР-9 / TIMP более 1. Дисбаланс между показателями экспрессии ММР-9 и TIMP в клетках печени у мышей оппозитных линий, перенесших ВКИ, возможно, связан с активностью клеток Купфера.

Ключевые слова:

матриксная металлопротеиназа-9, тканевой ингибитор матриксных металлопротеиназ-1, внутриутробное кандидозное инфицирование, печень, новорожденные мыши линий СВА и С57Вl/6

S.P. Mozoleva¹, A.P. Nadeev¹, ², S.V. Pozdnyakova¹, T.A. Ageeva¹

Expression of matrix metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of matrix metalloproteinases-1 in the liver in neonatal mice of CBA and C57B1 / 6 lines, that underwent intrauterine candidiasis infection

¹Novosibirsk State Medical University;
²Institute of Experimental and Clinical Medicine, Novosibirsk

Summary:

The goal of the research was to study the expression of MMP-9, TIMP-1 and their ratios in hepatocytes and nonparenchymal liver cells in neonatal mice of two opposing lines of CBA and C57B1 / 6, after an intrauterine candidiasis infection. The MMP-9 and TMP 1 expression and their ratio in the liver in neonatal mice of the CBA and C57B1 / 6 lines having had an intrauterine candidiasis are genetically determined. In the CBA mice, after an intrauterine candidiasis, a total expression values were higher compared to the C57Bl / 6 mice. In the newborn C57Bl / 6 mice after an intrauterine candidiasis, there was a weak expression of MMP-9 and a higher level of TIMP-1 expression in the cells of the hematopoiesis foci, sinusoidal cells, leading to MMP-9 / TIMP ratio of less than 1. In newborn CBA mice, the expressed expression of MMP-9 and a lower level of TIMP-1 expression in the cells of the hemopoiesis foci, sinusoidal cells, resulting in the ratio of MMP-9 / TIMP to be greater than 1. Imbalance between the expression of MMP-9 and TIMP in liver cells in mice of opposing lines that survived intrauterine candidiasis infection, is likely to be associated with activity of Kupffer cells.

Key words:

matrix metalloproteinase-9, tissue inhibitor of matrix metalloproteinases-1, intrauterine candidiasis infection, liver, newborns mice of CBA and C57Bl / 6 lines

Введение

К ведущим причинам мертворождаемости, младенческой смертности и ранней инвалидизации детей относят внутриутробные инфекции, вoзбудители которых спocобны преoдолевать плaцентарный барьер [5]. К инфекционным агентам, способным индуцировать развитие внутриутробной инфекции, относят грибы рода Candida spp. [9, 12, 13].

Компенсаторно-приспособительные реакции организма на внешнесредовые и стрессорные воздействия, в том числе при инфекционных заболеваниях, детерминированы гено- и фенотипом. Удобной моделью для выявления генетически обусловленных (индивидуальных) различий реакций на стрессорные стимулы являются мыши инбредных линий. Мыши линий СВА и C57BI/6 существенно отличаются по ряду физиологических и морфологических параметров органов и систем, цитокиновому, иммунному и эндокринному статусам [4, 5] и относятся к оппозитным линиям.

Печень является первым органом, куда попадают все трофические субстраты, микроорганизмы и/или их токсины, поступающие к плоду от матери и от ее морфофункционального состояния может зависеть исход инфицирования плода [4]. При этом клетки Купфера (КК) играют важную регулирующую роль в процессах повреждения и регенерации печени [1, 8, 11, 12].

При физиологических и патологических процессах эмбриогенеза, воспаления, ремоделирования ткани и репарации, мобилизации матрикс-связанных факторов роста, а также огромную роль в иммунопатогенезе поражений печени, играет соотношение матриксных металлопротеиназ (MMPs) и их тканевых ингибиторов (TIMPs) [11]. Протеолитическая активность MMPs регулируется балансом между активацией и подавлением проферментов посредством эндогенных субстратов, таких как альфа 2-макроглобулин, фактор некроза опухоли α, интерлейкины (IL-1, -6, -8, -15), факторы роста (эпидермальный фактор роста, VEGF), главными их источниками являются активированные макрофаги, нейтрофилы, фибробласты, и тканевые ингибиторы MMPs (TIMP). В норме TIMP-1 связываются с про-ММР-9 в соотношении 1:1, образуя нековалентные стехиометрические комплексы и блокируя активацию фермента [2, 7, 14]. Это обстоятельство определяет необходимость совместной оценки уровня экспрессии MMPs и их ингибиторов.

Цель исследования - изучить экспрессию ММР-9, TIMP-1 и их соотношения в гепатоцитах и непаренхиматозных клетках печени у новорожденных мышей двух оппозитных линий СВА и С57В1/6, после перенесенного внутриутробного кандидозного инфицирования (ВКИ).

Материалы и методы

Исследование выполнено на беременных мышах двух оппозитных линий СВА и С57В1/6 и их потомстве. Животные-производители (масса 20-22 г) были получены из лаборатории разведения экспериментальных животных Института цитологии и генетики СО РАН (г. Новосибирск).

Для моделирования ВКИ мышам-самкам на 13-й день беременности под наркозом в область плаценты каждого плода вводили 0,04 мл раствора с суточной культурой C. albicans из расчета 2,5×106 клеток возбудителя в 0,2 мл изотонического раствора натрия хлорида [6].

Новорожденные мышата были разделены на 4 группы по 10 животных в каждой: 1-я (линия СВА) и 2-я (линия С57В1/6) группы - новорожденные мышата с ВКИ; 3-я (линия СВА) и 4-я (линия С57В1/6) группы - контрольных (интактные) животные. Новорожденных мышей в течение первых суток после рождения выводили из эксперимента путем декапитации под эфирным наркозом.

Все манипуляции с лабораторными животными проводили, соблюдая "Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных" (Страсбург, 1986), принципы гуманности, изложенные в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС), "Принципы надлежащей лабораторной практики" (ГОСТ Р53434-2009 от 01.03. 2010 г. идентичен GLPOECD).

В соответствии со стандартизированными протоколами и рекомендациями фирмы-производителя антител проведены иммуногистохимические исследования с использованием моноклональных антител Rabbit MMP-9, clone 127 ("ThermoFisher Scientific Inc.", США), Mousea-Human TIMP-1, clone 102D1 ("ThermoFisher Scientific Inc.", США) и системы визуализации DAKO EnVision + System ("DAKO", Дания) с диаминобензидином (DAB).

Для количественной оценки экспрессии MMP-9 и ТІМР-1 в каждом наблюдении определяли процент положительно окрашенных клеток (гепатоцитов и непаренхиматозных) печени в 10 полях зрения с подсчетом среднего значения.

Статистическую обработку данных морфометрического исследования проводили с использованием лицензированного пакета программ статистики "Мicrosoft Excel 2010" c определением средней величины (М), стандартной ошибки средней (m). Достоверность статистически значимых различий средних величин в сравниваемых группах рассчитывали по t-критерию Стьюдента при p<0,05. При расчетах учитывали нормальность распределения исследуемого количественного признака (медиана близка к среднему значению (расхождение не более 20 %).

Результаты и обсуждение

При иммуногистохимическом исследовании цитоплазматической экспрессии ММР-9 и ТIМР-1 в печени у новорожденных мышей линий СВА и С57В1/6, перенесших ВКИ, регистрировали положительные реакции MMP-9 и ТІМР-1 в клетках очагов гемопоэза и синусоидальных клетках (крупнозернистый продукт реакции), редко - в гепатоцитах (гетерогенно в виде мелкодисперсного осадка), с различной выраженностью экспрессии (рисунок). У контрольных животных иммуногистохимическая реакция в клетках печени отсутствовала, что, вероятно, объясняется отсутствием нейтрофилов, а в КК количество фермента так мало, что практически не верифицировалось.

У мышей линии СВА, перенесших ВКИ, суммарный уровень цитоплазматической экспрессии ММР-9 (в клетках гемопоэза, синусоидальных клетках и гепатоцитах) в 3,29 раза превышал аналогичный показатель у мышей линии С57В1/6, уровень цитоплазматической экспрессии TIMP-1 - в 1,79 раза (таблица). Высокие показатели суммарной иммуногистохимической реакции обусловлены высокими значениями изучаемых показателей в клетках очагов экстрамедуллярного кроветворения и синусоидальных клетках, так как уровни экспрессии в гепатоцитах у мышей обеих линии, перенесших ВКИ, значимых различий не имели (таблица). Так, в клетках очагов экстрамедуллярного кроветворения у мышей линии СВА, перенесших ВКИ, уровень цитоплазматической экспрессии ММР-9 в 4,64 раза превышал аналогичный показатель у мышей линии С57В1/6, уровень цитоплазматической экспрессии TIMP-1 - в 2,27 раза, а соотношение MMP-9 / ТІМР 1 было >1,0. В синусоидальных клетках, в состав которых входят КК, являющиеся также продуцентами MMPs, у мышей линии СВА, перенесших ВКИ, уровень цитоплазматической экспрессии ММР-9 в 1,2 раза превышал аналогичный показатель у мышей линии С57В1/6. Уровень цитоплазматической экспрессии TIMP-1 у мышей разных линий, внутриутробно инфицированных С. albicans, значимых различий не имел. При этом, соотношение MMP-9 / ТІМР-1 у мышей линии СВА, перенесших ВКИ, было >1,0 (таблица).

Рис. Экспрессия TIMP-1 в клетках печени новорожденных мышей линии СВА, перенесшей внутриутробное кандидозное инфицирование: TIMP-1 окрашенный продукт визуализируется гомогенно в клетках очагов экстрамедуллярного кроветворения, синусоидальных клетках, отдельных гепатоцитов. Докраска гематоксилином. Ув. × 100

Вероятно, разнонаправленная динамика значений соотношения ММР-9 / ТІМР-1 у новорождённых мышей разных линий, перенесших ВКИ, обусловлена генетическими различиями их чувствительности к инфекции и сопряжена с преобладанием клеточного (Th1) или гуморального (Th2) типов иммунного ответа [13], ролью морфофункционального состояния фагоцитов являющихся одними из основных продуцентов исследуемых ферментов на ранних этапах инфекционного процесса [3, 4]. У мышей линии C57Bl/6, имеющих Н-2Ь гаплотип и генетически "склонных" к формированию клеточного иммунного ответа [13] ВКИ сопровождается экспрессией ТІМР-1 в клетках очагов экстрамедуллярного кроветворения и синусоидальных клетках печени, в количестве, которое способно ограничивать протеолитическую активность ММП-9 и, соответственно, вести к ослаблению ответа ММР-9 (MMP-9 / ТІМР-1 (< 1,0)) и несостоятельности завершенности фагоцитоза. Видимо, несостоятельность завершенности фагоцитоза у таких мышей может способствовать длительной персистенции живого возбудителя в вакуолярном аппарате КК при внутриутробном инфицировании животных и возможности генерализации инфекционного процесса при определенных условиях. Ранее было показано, что в части фагосом КК у мышей линии C57BI/6 были выявлены С. аlbicans, а при инфицировании С. albicans в печени взрослых мышей этой линии на ранних сроках определялось большее число гранулем (в основе гранулематозного воспаления лежат механизмы незавершенного фагоцитоза) в сравнении с мышами линии СВА. Мыши линий СВА, характеризующиеся преобладанием гуморального иммунитета (Th2), имели более выраженную экспрессию ММP-9 и отставание в экспрессии ТІМР-1 (MMP-9 / ТІМР-1 (> 1,0), что отразилось в высокой эффективности фагоцитоза С. albicans макрофагами у мышей этой линии [5].

Таблица. Экспрессия ММР-9 и TIMP-1 в клетках печени новорожденных мышей линий СВА и С57В1/6, внутриутробно инфицированных С. albicans (M±m)
Локализация	Линия мышей
	CBA	C57BI/6
	экспрессия MMP-9
Гепатоциты	0,04±0,02	отсутствует
Клетки очагов гемопоэза	7,85±0,50*	1,69±0,06*
Синусоидальные клетки, включая клетки Купфера	1,26±0,05*	1,05±0,05*
Суммарный показатель	9,19±0,432*	2,79±0,06*
	экспрессия ТІМР-1
Гепатоциты	0,07±0,02	0,05±0,05
Клетки очагов гемопоэза	6,62±0,46*	2,92±0,51*
Синусоидальные клетки, включая клетки Купфера	1,04±0,14	1,37±0,12
Суммарный показатель	7,81±0,51*	4,37±0,47*
	соотношение MMP-9/ ТІМР-1
Гепатоциты	0,58±0,03	0±0
Клетки очагов гемопоэза	1,23±0,15*	0,57±0,08*
Синусоидальные клетки, включая клетки Купфера	1,44±0,12*	0,77±0,04*
Суммарный показатель	1,20±0,13*	0,65±0,08*

Примечание. * - достоверные межлинейные различия средних величин соответствующих параметров, р<0,05.

Полученные данные могут служить обоснованием необходимости учета индивидуальных особенностей реагирования плода и новорожденных на внутриутробное инфицирование и могут быть положены в основу методических подходов для прогнозирования индивидуальных рисков патологий у детей.

Выводы

1. Экспрессии ММР-9 и ТМР-1 и их соотношение в печени у новорожденных мышей линий СВА и С57В1/6, перенесших ВКИ, генетически детерминированы. У мышей линий СВА, перенесших ВКИ, суммарные показатели экспрессии имели более высокие значения по сравнению с мышами линии C57Bl/6.

2. У новорожденных мышей линии C57Bl/6, перенесших ВКИ, выявлена слабая экспрессия ММР-9 и более высокий уровень экспрессии TIMP-1 в клетках очагов гемопоэза, синусоидальных клетках, что обусловило соотношение ММР-9 / TIMP менее 1. У новорожденных мышей линии CBA, перенесших ВКИ, отмечена выраженная экспрессия ММР-9 и более низкий уровень экспрессии TIMP-1 в клетках очагов гемопоэза, синусоидальных клеток, что обусловило соотношение ММР-9 / TIMP более 1.

3. Дисбаланс между показателями экспрессии ММР-9 и TIMP в клетках печени у мышей оппозитных линий, перенесших ВКИ, возможно, связан с активностью клеток Купфера

Литература

1. Люндуп А.В., Онищенко Н.А., Крашенинников М.Е., Шагидулин М.Ю. О роли синусоидальных клеток печени и клеток костного мозга в обеспечении регенераторной стратегии здоровой и поврежденной печени // Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2010. - Т. XII, № 1. - С. 78-85.
2. Мазовка К.Е., Ткачев А.В. Экспрессия матриксной металлопротеиназы-9 и тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы-1 в слизистой оболочке кишечника у больных с воспалительными заболеваниями кишечника в зависимости от активности заболевания // Практическая медицина. - 2014. - № 1. - С. 53-56.
3. Маркелова Е.В., Здор В.В., Романчук А.Л., Бирко О.Н. Матриксные металлопротеиназы их взаимосвязь с системой цитокинов, диагностический и прогностический потенциал // Иммунопатология, Аллергология. Инфектология. - 2016. - № 2. - С. 11-22.
4. Мозолева С.П., Надеев А.П., Позднякова С.В., Залавина С.В. Структурная организация печени и звездчатых макрофагов у новорожденных мышей линии СВА и С57В1/6 // Морфология. - 2017. - Т. 152, № 4. - С. 44-48.
5. Надеев А.П., Шкурупий В.А., Маринкин И.О. Печень и плацента в пре- и постнатальный периоды при патологии: Клинико-экспериментальное исследование. - Новосибирск: Наука, 2014. - 242 с.
6. Надеев А.П., Шкурупий В.А. Способ моделирования кандидозной инфекции у экспериментальных животных // Патент России 2289853, 2006. - Бюлл. № 35.
7. Потеряева О.Н. Матриксные металлопротеиназы: строение, регуляция, роль в развитии патологических состояний (обзор литературы) // Медицина и образование в Сибири. 2010. - № 5. - С. 7-17.
8. Элбакидзе, Г.М., Меденцев А.Г. Внутриорганные и внутритканевые механизмы регуляторных воздействий клеток Купфера на гепатоциты // Вестник РАМН. - 2013. - № 2. - С. 50-54.
9. Groll A. H., Walsh T. J. Fungal infections in the pediatric patient. In: E. J. Anaissie, et al. ed. Clinical mycology. - NewYork: Churchill Livingstone, 2003. - Р. 417-442.
10. Han Y.P., Zhou L., Wang J., et al. Essential role of matrix metalloproteinases in interleukin-1-induced myofibro blastic activation of hepatic stellate cell in collagen // J. Biol. Chem. - 2004. - Vol. 279. - P. 4820-4828.
11. Ju C., Tacke F. Hepatic macrophages in homeostasis and liver diseases: from pathogenesis to novel therapeutic strategies // Cell. Mol. Immunol. - 2016. - Vol. 13. - P. 316-27.
12. Kaufman D., Fairchild K. D. Clinical microbiology of bacterial and fungal sepsis in very-low-birth-weight infants // Clinical Microbiology Reviews. - 2004. - Vol. 17, № 3. - P. 638-680.
13. Paula M.O., Fonseca D.M, Wowk P.F., et al. Host genetic background affects regulatory T-cell activity that influences the magnitude of cellular immune response against Mycobacterium tuberculosis // Immunol. Cell. Biol. - 2010. - Vol. 89, № 42. - P. 526-534.
14. Zitka O., Kukacka J., Krizkova S., Huska D., Adam V., Masarik M., Prusa R., Kizek R. Matrix metalloproteinases // Curr. Med. Chem. - 2010. - Vol. 17, № 31. - P. 3751-3768.