2019 год № 3

Резюме:

Ключевые слова:

Summary:

Key words:

Введение

В последние годы во многих странах, в том числе в Российской Федерации, стала отчётливо проявляться тенденция к злоупотреблению аптечными препаратами, обладающими влиянием на центральную нервную систему [3, 7]. Место среди них занял и противоэпилептический препарат - прегабалин. Прегабалин входит в список жизненно важных лекарственных препаратов и включен в стандарты РФ по оказанию медицинской помощи. Эффективно применяется в неврологической практике: при лечении невропатической боли, в качестве дополнительной терапии с парциальными судорожными припадками, при фибромиалгии [6, 8].

Наряду с медицинским применением отмечено использование прегабалина с целью получения удовольствия [4]. Данный препарат усиливает действие опиатов, этанола. Для состояния опьянения характерны: сонливость, атаксия, нарушение координации и концентрации внимания, спутанность сознания, приподнятое настроение [5].

Исходя из вышесказанного, детектирование лекарственных средств, обладающих способностью изменять сознание человека, является серьёзной и актуальной проблемой, как для медицинского сообщества, так и для правоохранительных органов. В связи с этим, возникает необходимость разработки методик определения прегабалина в биологических жидкостях с помощью универсальных, экспрессных, чувствительных и точных методов анализа.

Целью настоящего исследования является разработка методики определения прегабалина методом газожидкостной хроматографии.

Материалы и методы

В качестве объекта исследования использовали прегабалина раствор 1,5 мг/мл, путём разведения готовили растворы с концентрацией 0,25-1,0 мг/мл и 10-100 мкг/мл, с учетом токсических и терапевтических дозировок. Также готовили модельные смеси мочи с содержанием прегабалина в концентрациях 15-120 мкг в пробе, в том числе и с добавлением внутреннего стандарта - дифениламина (1 мг/мл, добавляли в пробу 50 мкл).

После выделения прегабалина из модельных смесей пробы анализировали на газожидкостном хроматографе Хроматэк-Кристалл 5 000 (г. Йошкар-Ола, ЗАО ОКБ "Хроматэк"). В ходе эксперимента с прегабалина раствором 1,5 мг/мл были предложены следующие условия хроматографирования: колонка НР-5 длиной 30 м; скорость потока газоносителя (азот) - 17,7 мл/мин.; температура термостата колонки начальная - 170 °C; скорость нагрева до температуры 220 °C - 20 °С/мин.; температура детектора - 250 °C; температура испарителя - 230 °C; ввод пробы с делением потока 1/30; объем вводимой пробы - 1 мкл.

В данных условиях время анализа составило 15 минут. Время удерживания в среднем для анализируемого вещества (прегабалина) составило 5,50 мин., время удерживания дифениламина - 10,15 мин.

Результаты и обсуждение

При определении прегабалина существует необходимость в количественной оценке анализируемого вещества в пробах для установления факта его немедицинского применения.

Основным параметром хроматограммы, характеризующим количество анализируемого вещества, является площадь хроматографического пика [2]. Для количественного определения использовали два метода: метод абсолютной калибровки и метод внутреннего стандарта.

Полученные градуировочные графики характеризовались линейностью и имели вид для концентраций 0,25-1,5 мг/мл: метод внутреннего стандарта - Sпрег/Sдфа = 0,8485×С (R²=0,9966), метод абсолютной градуировки - Sпpег=964,02×С (R²=0,9911); для концентраций 10-100 мкг/мл: метод внутреннего стандарта - Sпрег/Sдфа=0,0005×С (R²=0,9958), метод абсолютной градуировки - Sпpeг=0,5707×С (R²=0,9941).

При проведении валидационных исследований были установлены такие характеристики методики как специфичность, линейность, правильность и прецизионность (в условиях повторяемости).

Для оценки специфичности сравнивали результаты определения раствора прегабалина 1,5 мг/мл, модельной смеси мочи с прегабалином и холостой пробы мочи. Анализ хроматограмм показал, что посторонние пики не мешают достоверному определению прегабалина (рис. 1).

Рис. 1. Хроматограммы экстракта холостой пробы мочи (справа) и экстракта из модельной смеси мочи (слева)

Линейность методики оценивали с помощью модельных смесей мочи с прегабалином 15-120 мкг в пробе и модельных смесей мочи с прегабалином и внутренним стандартом (дифениламином) в тех же концентрациях. Хроматографировали экстракты, полученные после изолирования перегабалина из проб модельных смесей. Определили площади пиков прегабалина и дифениламина, находили соотношение площадей и строили графики зависимости (рис. 2).

Для оценки правильности и прецизионности методики проводили анализ модельных смесей мочи с прегабалином с концентрациями 30, 60 и 90 мкг в пробе в 6 повторностях. Повторяемость (сходимость) оценивали по результатам, полученным в одних условиях в одной лаборатории (один исполнитель, одно оборудование) в короткий промежуток времени. Для каждого из трёх уровней рассчитывали дисперсию, стандартное отклонение, относительную ошибку. В ходе статистической обработки были получены приемлемые результаты (таблица).

Рис. 2. Градуировочные графики определения прегабалина методом абсолютной градуировки (справа), методом внутреннего стандарта (слева)

Относительные ошибки результатов не превышают 15 %, что свидетельствует о возможности использования разработанной методики для анализа биологических жидкостей на содержание прегабалина [1].

Выводы

1. Подобраны оптимальные условия хроматографирования прегабалина методом ГЖХ, установлены его хроматографические параметры (время удерживания), получены графики зависимости площадей пиков от концентраций прегабалина).

2. Предложенные хроматографические условия апробированы на модельных смесях мочи.

3. Проведена валидационная оценка методики определения прегабалина методом ГЖХ по параметрам: специфичность, линейность, правильность, прецизионность (в условиях повторяемости).

Литература

1. 1. Барсегян С.С. и др. Методические рекомендации по валидации аналитических методик, используемых в судебно-химическом и химикотоксикологическом анализе биологического материала. - М: Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский центр судебно-медицинской экспертизы" Министерства здравоохранения Российской Федерации, 2014. - 73 с.
2. 2. Краснов Е.А. Современные хроматографи­ческие методы (ГЖХ, ВЭЖХ) в фармацевтическом анализе [Электронный ресурс]: уч. пособие / Е.А. Краснов, А.А. Блинникова. - Томск: Сибирский государственный медицинский университет, 2006. - 152 с. - Режим доступа: http://www.studfiles.ru/preview/2245353.
3. 3. Мохначев С.О. и др. Злоупотребление аптечными препаратами // Человек и лекарство: сборник материалов конгресса. - М: РИЦ "Человек и лекарство", 2011. - 618 с.
4. 4. Пискунов М.В. Случаи зависимости от лекарственного препарата прегабалин ("лирика") / М.В. Пискунов, А.Н. Кривенков, Н.Ю. Сорокина // Наркология. - 2012. - № 6. - С. 64-69.
5. 5. Правдюк М.Ф. и др. Разработка методики анализа производных ГАМК в биологических средах человека // Актуальные проблемы фармацевтической науки и практики: сб. науч. тр. / Северо-Осетинский государственный университет им. К.Л. Хетагурова. - Владикавказ, 2014. - С. 301-307.
6. 6. Регистр лекарственных средств России [Электронный ресурс]. Режим доступа: https://www.iisnet.ru/tn index id 55789.htm.
7. 7. Рохлина М.Л. и др. Злоупотребление прегабалином (лирикой) // Вопросы наркологии. - 2015. - № 3. - С. 9-15.
8. 8. Строков И.А. Лечение невропатической боли при диабетической полиневропатии // Рус. мед. журн. - 2008. - Т. 16, № 28. - С. 1892-1896.