2020 год № 1

Резюме:

Ключевые слова:

Summary:

Key words:

Введение

В настоящее время доказано, что клетки головного мозга, в том числе нейроны, являются обновляющейся популяцией. Имеется множество доказательств дифференцировки нейральных стволовых клеток как в глиоциты, так и в нейроны. Данный процесс является многоступенчатым, он начинается с трансформации нейрональных и глиальных предшественников, проходит ряд промежуточных стадий и завершается включением дифференцированных нейронов в нейрональную сеть [1, 2, 3]. Основными зонами расположения региональных нейральных стволовых клеток во взрослом мозге являются субвентрикулярная зона боковых желудочков и зубчатая извилина гиппокампа, обозначаемых как специальные ниши стволовых клеток, микроокружение которых позволяет им сохранять свою идентичность, влияет на пролиферацию и дифференцировку их потомков. При этом данные положения считаются справедливыми как для развивающегося, так и для взрослого мозга [1, 2, 6, 9, 13].

Нейрогенез в течение ранних этапов органогенеза мозга имеют важнейшее значение для определения его свойств в последующем. Это относится, в частности, к перинатальному и молочному периодам онтогенеза, в течение которых у таких животных как крысы происходит увеличение массы органа более чем в 5 раз [5, 7, 8], обеспечиваемое в значительной мере нейрогенезом. В связи с этим представляет интерес вопрос об интенсивности в данном отрезке онтогенеза пролиферации в различных нейрогенных нишах. Изучению данного вопроса посвящена настоящая работа.

Материалы и методы

Исследовался головной мозг 5- и 14-суточных крыс линии Вистар, потомства 4-5 месячных интактных самцов и самок. Все животные родились в пометах средней величины (число крысят - 8-10). В работе исследовались животные 2 групп. В первой - изучались крысы в возрасте 5 суток (неонатальный период), во второй - в возрасте 14 суток (молочный период). Крысы обеих групп содержались в одинаковых условиях вивария, корм и воду получали ad libitum. Содержание животных и эвтаназия проводились согласно "Правилам проведения работ с экспериментальными животными" (Приложение к приказу МЗ СССР № 755 от 12.09. 1977 г.).

Эвтаназия животных 1-й группы была проведена в возрасте 5 суток, 2-й - в возрасте 14 суток. Определялись масса тела и головного мозга животных. Головной мозг фиксировали в цинк-этанол-формальдегиде [4] в течение 24 часов. Затем его переносили в 90 % этанол и заливали в парафин. Иммуногистохимическое исследование проводили с определением экспрессии маркера пролиферативной активности Ki67 по стандартному протоколу на срезах толщиной 4 мкм, прошедших в области собственно теменной доли, с использованием моноклональных мышиных антител к Ki67 (клон MM1, Leica). Препараты подвергались обзорному изучению, исследовалась доля Ki-67-позитивных клеток в субвентрикулярной зоне боковых желудочков, зубчатой извилине и поле I гиппокампа. Цифровые микрофотографии нейрогенных ниш и неокортекса, полученные при увеличении микроскопа 15× 40, импортировались в программу Видеотест - Морфология 5, в которой определяли долю Ki67-иммунопозитивных структур, рассчитывавшуюся как процент иммунопозитивных клеток к их общему числу в исследуемых зонах полушария на основании подсчета на 700-1 000 клеток зубчатой извилины и поля I гиппокампа, 150-250 клеток субвентрикулярной зоны. Меньшее число клеток, на котором проводилось определение доли Ki-67-позитивных клеток в субвентрикулярной зоне, было обусловлено меньшими размерами этой зоны и меньшим числом клеток в ней.

Статистическая обработка материала проведена в программе Statistica 6. Проводился подсчет относительных показателей, средних арифметических величин и их стандартных ошибок. Достоверность отличий между группами оценивалась с применением t-критерия Стьюдента с поправкой для малых групп и критерия Фишера. Межгрупповые различия считали статистически значимыми при р<0,05.

Результаты и обсуждение

Обзорное изучение препаратов показало, что Ki67-позитивные клетки выявляются в разных отделах полушарий головного мозга крыс (рис. 1-4). При определении таких клеток у 5-суточных животных (1-я группа) было установлено, что как в 1-й, так и во 2-й подгруппе их максимальная доля характерна для субвентрикулярной зоны в области боковых желудочков, средняя - для зубчатой извилины, минимальная - для поля I гиппокампа. При расчете показателей на всю 1-ю группу было установлено, что плотность расположения Ki67-позитивных клеток в зубчатой извилине гиппокампа составляла 70,8 % от таковой в субвентрикулярной зоне. В поле I гиппокампа число Ki67-позитивных клеток было существенно меньшим, что обнаруживалось как при обзорном изучении препаратов, так и при их подсчете (рис. 1-3, табл.). Оно равнялось 12,7 % от имевшегося в субвентрикулярной зоне.

Значительный процент пролиферирующих клеток в исследованных зонах мозга соответствуют данным об их ведущей роли как ниш, где локализована основная часть стволовых нейральных клеток мозга млекопитающих, в частности, грызунов [1, 5, 9, 10, 11, 12, 13]. Изучение неокортекса показало, что здесь также имеются Ki67-позитивные клетки, плотность расположения которых здесь была значительно меньшей, чем в субвентрикулярной зоне и гиппокампе, а их расположение было неравномерным в разных участках неокортекса, даже в пределах одного слоя коры и одной корковой колонки (рис. 1-4).

Рис. 1. Ki67-позитивные клетки в субвентрикулярной зоне бокового желудочка мозга 5-суточной крысы. Увеличение 15× 40

Рис. 2. Ki67-позитивные клетки в зубчатой извилине гиппокампа 5-суточной крысы. Увеличение 15× 40

Рис. 3. Ki67-позитивные клетки в поле 1 гиппокампа 5-суточной крысы. Увеличение 15× 40

Рис. 4. Ki67-позитивные клетки в неокортексе 5-суточной крысы. Увеличение 15× 40

У 14-суточных крыс соотношение плотности расположения Ki67-позитивных клеток в разных нейрогенных нишах имело общие черты с наблюдавшимся у 5-суточных животных. Максимальная доля пролиферирующих клеток была в субвентрикулярной зоне боковых желудочков, минимальная - в поле I гиппокампа. Вместе с тем, сопоставление соотношения интенсивности пролиферации в изучавшихся зонах мозга обнаружило и отличия от имевшегося у 5-суточных крыс. В мозге 14-суточных животных пролиферативная активность в зубчатой извилине составляла лишь 16,5 % от имевшейся в субвентрикулярной зоне, то есть была в 4,2 раза меньше, чем у 5-суточных. В то же время, плотность расположения этих клеток в поле I гиппокампа равнялась 11,9 % от имевшейся в субвентрикулярной зоне, то есть соотношение числа Ki67-позитивных клеток в этих двух зонах было близким к наблюдавшемуся у 5-суточных крыс.

Таким образом, как у 5-суточных, так и у 14-суточных крыс доля Ki67-позитивных клеток была наиболее высокой в субвентрикулярной зоне. В зубчатой извилине мозга крыс этот показатель существенно различался у 5- и 14-суточных животных, значительно уменьшаясь в мозге последних. В поле I гиппокампа интенсивность пролиферации как у 5-, так и у 14-суточных крыс была ниже, чем в субвентрикулярной зоне и зубчатой извилине (таблица).

Сопоставление доли Ki67-позитивных клеток в разных нейрогенных нишах у 5- и 14-суточных крыс позволяет предполагать, что в этом возрастном интервале, характеризующемся интенсивным ростом массы мозга, происходят изменения значимости разных нейрогенных ниш в увеличении численности образующихся нейронов и глиоцитов, вносящем важный вклад в более чем двукратное увеличение массы мозга (табл.) и полушария, а также толщины его коры [7].

Оценивая полученные результаты, следует принимать во внимание, что они отражают долю Ki67-позитивных клеток, а не их суммарное количество в каждом из исследованных отделов мозга, поскольку оно зависит и от размеров каждой из нейрогенных ниш. Это следует особо отметить в связи с тем, что в настоящей работе изучались показатели пролиферативной активности у животных, мозг которых имел достоверные различия по массе (таблица). В связи с этим для интегральной оценки пролиферативного потенциала каждой из нейрогенных ниш необходимы данные не только о доле клеток, метящихся маркерами пролиферации, но и данные об объеме каждой из этих ниш, численности клеток в них. Получение такой информации требует проведения специальных исследований.

В то же время, мы полагаем, что полученные в работе результаты могут представлять интерес при изучении пролиферативной активности предшественников нейронов и глиоцитов в разных нейрогенных нишах головного мозга в ранние периоды постнатального онтогенеза в норме, а также при различных экспериментальных воздействиях.

В работе установлены соотношения показателей пролиферативной активности в разных нейрогенных нишах головного мозга крыс, показаны их различия в неонатальном и молочном периодах онтогенеза. Полученные результаты могут представлять интерес при исследованиях онтогенетического развития мозга в норме, патологии и при экспериментальных воздействиях.

Литература

1. 1. Гомазков О.А. Нейрогенез как организующая функция взрослого мозга. Достаточно ли доказательств? // Успехи современной биологии. - 2016. - Т. 136, № 3. - С. 227-246.
2. 2. Гомазков О.А. Сигнальные молекулы как регуляторы нейрогенеза взрослого мозга // Нейрохимия. - 2013. - Т. 30, № 4. - С. 273-288.
3. 3. Комлева Ю.К., Осипова Е.Д., Моргун А.В., Тепляшина Е.А., Салмин В.В., Малиновская Н.А., Пожиленкова Е.А., Салмина А.Б. Современные технологии культивирования стволовых клеток головного мозга // Цитология. - 2018. - Т. 60, № 8. - С. 587-597.
4. 4. Коржевский Д.Э., Григорьев И.П., Отеллин В.А. Применение обезвоживающих фиксаторов, содержащих соли цинка, в нейрогистологических исследованиях // Морфология. - 2006. - Т. 129, № 1. - С. 85-86.
5. 5. Матвеева Е.П., Рыжавский Б.Я. Морфометрические особенности субвентрикулярной зоны мозга новорожденных крыс, различающихся величиной массы мозга и степенью развития неокортекса // Дальневосточный медицинский журнал. - 2011. - № 4. - С. 93-95.
6. 6. Ревищин Ф.В., Пустогаров Н.А., Нерадовский А.В., Павлова Г.В. Нейрогенные ниши взрослого мозга млекопитающих // Цитология. - 2016. - Т. 58, № 6. - С. 478-481.
7. 7. Рыжавский Б.Я. Развитие головного мозга: отдаленные последствия влияния некомфортных условий. - Хабаровск: Изд-во ДВГМУ, 1990. - 278 с.
8. 8. Рыжавский Б.Я, Рудман Ю.Ю, Учакина Р.В. Особенности гистофизиологии яичников и надпочечников самок крысы, дающих потомство с опережающим развитием головного мозга // Морфология. - 2005. - № 4. - С. 101-104.
9. 9. Biran V., Joly L.M., Héron A., Vernet A., Véga C., Mariani J., Renolleau S., Charriaut-Marlangue C. Glial activation in white matter following ischemia in the neonatal P7 rat brain // Exp Neurol. - 2006. - Vol. 199, № 1. - Р. 103-112.
10. 10. Buono K.D., Goodus M.T., Guardia Clausi M. Jiang Y., Loporchio D., Levison S.W. Mechanisms of mouse neural precursor expansion after neonatal hypoxia-ischemia // J Neurosci. - 2015. - Vol. 35, № 23. - Р. 8855-8865.
11. 11. Guzzetta A., Baldini S., Bancale A., Baroncelli L., Ciucci F. Massage accelerates brain development and the maturation of visual function // Neuroscience. - 2009. - Vol. 29, № 18. - P. 6042-6051.
12. 12. Kriegstein A.R., Gotz M. Radial glia diversity: a matter of cell fate // Glia. - 2003. - Vol. 43. - P. 37-43.
13. 13. Spiegler M., Villapol S., Biran V., Goyenvalle C., Mariani J., Renolleau S., Charriaut-Marlangue C. Bilateral changes after neonatal ischemia in the P7 rat brain // J. Neuropathol. Exp. Neurol. - 2007. - Vol. 66, № 6. - Р. 481-90.