2022 год № 3

Аннотация:

Ключевые слова:

Abstract:

Key words:

Введение

Повреждающие воздействия в ранние онтогенетические периоды развития организма являются факторами риска развития множества заболеваний нервной системы: депрессии [15], биполярного расстройства [10], шизофрении [9], болезни Альцгеймера [12]. Внутриутробная гипоксия играет существенную роль в патогенезе синдрома дефицита внимания и гиперактивности у детей, основными проявления которого являются нарушения внимания и двигательная расторможенность [6].

В ранее проведенных в нашей лаборатории исследованиях было установлено, что внутриутробная гипоксия (ВУГ) вызывает поведенческие отклонения у половозрелых белых крыс. Животные, подвергнутые ВУГ, проявляли признаки тревожности, повышенной двигательной активности и рискованного поведения [8]. Введение неопиатного аналога лей-энкефалина (пептида НАЛЭ - Phe - D-Ala - Gly - Phe - Leu - Arg) в неонатальном периоде вызывало нормализацию ряда поведенческих показателей. Пептид НАЛЭ не может действовать через опиоидные рецепторы, так как в его структуре отсутствует - N-концевая аминокислота тирозин, ответственная за аффинность к ним [13]. Механизмы нейропротективного действия пептида НАЛЭ оставались неясными.

В связи с этим, целью настоящего исследования была оценка роли C-концевой аминокислоты аргинин и системы оксида азота в реализации поведенческих эффектов пептида НАЛЭ.

Материалы и методы

Эксперименты были выполнены на белых крысах Вистар (n=230). Содержание животных осуществляли в соответствии с ГОСТ 33216-2014 "Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами". На проведение исследования было получено разрешение этического комитета ФГБОУ ВО ДВГМУ Минздрава России (протокол № 2 от 05.12.2019).

Для создания модели ВУГ, 3-месячных беременных крыс-самок помещали в барокамеру и подвергали гипобарической гипоксии ежедневно с 15 по 19 сутки беременности в течение 4 часов (с 9:00 до 13:00). При этом имитировали подъем на высоту 8 000 м над уровнем моря, что соответствовало давлению 294 мм рт. ст. и парциальному давлению кислорода 46 мм рт. ст. По данным литературы, такая гипоксия расценивается как тяжелая [3].

Хэндлинг новорожденного потомства с ежедневным отлучением от матери для внутрибрюшинного инъецирования растворов с 2 по 6 сутки жизни считали моделью эмоционально-болевого воздействия.

Осуществляли введение новорожденным животным следующих веществ:

0,9 % раствор хлорида натрия;

пептид НАЛЭ (H - Phe - D-Ala - Gly - Phe - Leu - Arg - OH; ООО "Алмабион", Россия);

пептид G (H - Phe - D-Ala - Gly - Phe - Leu - Gly - OH; ООО "Алмабион", Россия) - отличается от пептида НАЛЭ заменой С-концевой аминокислоты аргинин на глицин;

L-NAME (Sigma-Aldrich, США) - неселективный ингибитор фермента NO-синтетазы.

Введение исследуемых веществ производилось с 2 по 6 сутки жизни ежесуточно в дозах: пептид НАЛЭ 100 мкг/кг, пептид G 100 мкг/кг; L-NAME 50 мг/кг. Объем вводимых растворов - 0,1 мл.

Животные были разделены на 6 групп: группа "Контроль" (n=36) - интактные животные, не подвергавшиеся какому-либо воздействию; группа "ЭБВ" (n=15) - крысы, перенесшие эмоционально-болевое воздействие с введением 0,9 % раствора хлорида натрия в периоде новорожденности; группа "ВУГ" (n=14) - крысы, перенесшие ВУГ и эмоционально-болевое воздействие с введением 0,9 % раствора хлорида натрия в периоде новорожденности; группа "ВУГ+НАЛЭ" (n=20) - крысы, перенесшие ВУГ и введение в периоде новорожденности пептида НАЛЭ; группа "ВУГ+G" (n=18) - крысы, перенесшие ВУГ и введение в периоде новорожденности пептида G; группа "ВУГ+НАЛЭ+L-NAME" (n=16) - крысы, перенесшие ВУГ, и введение в периоде новорожденности пептида НАЛЭ и L-NAME.

Поведение животных исследовали на 7 и на 30 сутки жизни. Поскольку в эти возрастные периода белые крысы являются неполовозрелыми, проводили оценку поведения животных обоего пола.

Для оценки поведения 7-суточных животных проводили тест "Отрицательный геотропизм": фиксировали время полного разворота животного для получения корректного расположения в гравитационном поле Земли. Для оценки поведения 30-суточных животных проводили тесты "Приподнятый крестообразный лабиринт" и "Открытое поле". В тесте "Приподнятый крестообразный лабиринт" регистрировали следующие показатели: время нахождения в центре лабиринта, время нахождения в закрытых и в открытых рукавах, количество входов в открытые и закрытые рукава, общую двигательную активность, время бездействия, время движения, время груминга, количество грумингов, свешиваний и актов дефекаций. В тесте "Открытое поле" регистрировали показатели: время движения и бездействия, количество стоек, грумингов, принюхиваний и актов дефекаций, количество пересечений центральных и периферических секторов. Методики проведения поведенческих тестов отработаны в нашей лаборатории и многократно описаны в литературе [2, 4].

Статистическая обработка данных проводилась с помощью программ Excel и Statistica 7.0. Количественные данные проверялись на нормальность распределения с помощью теста Шапиро-Уилка и графического представления распределения. В случае нормального распределения для сравнения двух независимых выборок применялся t-критерий Стьюдента. Для сравнения дисперсий применяли критерий Ливеня. Выборки с ненормальным распределением сравнивали с использованием критерия Манна-Уитни (если дисперсии были равны) или критерия Колмогорова-Смирнова (если дисперсии были не равны). Для отображения данных в тексте и в таблицах использовали показатель медианы, после которого в квадратных скобках указывали первый и третий квартиль (Me [Q₁; Q₃]). Для всех критериев и тестов уровень значимости принимался равным 0,05.

Результаты и обсуждение

У 7-суточных белых крыс, подвергавшихся с 2 по 6 сутки жизни хэндлингу и внутрибрюшинному введению физиологического раствора (группа ЭБВ), мы наблюдали статистическую тенденцию к увеличению времени разворота в тесте "Отрицательный геотропизм" (Ме_{контроль}=7,7 [4,8; 13,03]; Me_ЭБС=10,7 [7,43; 14,53]; 0,05<р<0,1). Это может говорить о замедлении созревания сенсорно-двигательных рефлексов у новорожденных животных. В возрасте 30 суток эти животные демонстрировали достоверное возрастание количества дефекаций в тесте "Приподнятый крестообразный лабиринт" (табл. 1). Изменения остальных характеристик не были статистически достоверными. Тем не менее, мы зафиксировали уменьшение времени нахождения в открытых рукавах (на 40 %), снижение количества свешиваний (до 0) и увеличение времени груминга (на 53 %). В тесте "Открытое поле" была выявлена статистическая тенденция (0,05<р<0,1) к увеличению количества посещений центральных секторов, существенное (на 50%) возрастание количества посещений периферических секторов и дефекаций (табл. 2). Таким образом, 30-суточные животные, перенесшие ЭБВ в периоде новорожденности, демонстрировали увеличение горизонтальной двигательной активности ("двигательную расторможенность") и вегетативный дисбаланс. Полученные нами данные сходны с опубликованными ранее [8, 7].

Последствия неонатального стресса были значительно более выраженными у животных, перенесших ВУГ в сочетании с неонатальным введением физиологического раствора (группа "ВУГ"). В тесте "Отрицательный геотропизм" у животных этой группы отмечалось достоверное (на 65 %) увеличение времени разворота по сравнению с контрольной группой (Ме_{контроль}=7,7 [4,8; 13,03]; MeВУГ= 12,8 [9,57; 17]; р<0,05). У 30-суточных животных группы "ВУГ" в тесте "Приподнятый крестообразный лабиринт" не было получено статистически достоверных отличий по сравнению с контрольной группой (таблица 1). При этом следует отметить следующие изменения: возрастание общей двигательной активности (на 75 %) и времени груминга (на 25 %). В тесте "Открытое поле" достоверно увеличилось количество грумингов (в 2,5 раза); значимо повысилось количество дефекаций (в два раза) (табл. 2). Повышение количества и времени груминга в литературе описываются термином "смещенная двигательная активность", которая отражает уровень тревожности у животных [5]. Подобные изменения описывают и другие авторы, работы которых посвящены реакциям экспериментальных животных на стрессовые воздействия [1]. Полученные результаты свидетельствуют, что 30-суточные животные, подвергнутые ВУГ и неонатальному эмоционально-болевому стрессу, демонстрируют усиленную тревожность и "двигательную расторможенность".

У 7-суточных крыс, получавших инъекции пептида НАЛЭ после ВУГ (группа "ВУГ+НАЛЭ"), мы наблюдали нормализацию времени разворота в тесте "Отрицательный геотропизм": по этому показателю данная группа животных не отличалась достоверно от контрольной группы (Ме_{контроль}=7,7 [4,8; 13,03]; MeВУГ+НАЛЭ=9,3 [7,92; 13;84]; р>0,05). У 30-суточных животных группы "ВУГ+НАЛЭ" в тесте "Приподнятый крестообразный лабиринт" время нахождения в центре лабиринта было достоверно больше по сравнению с контролем (табл. 1). При анализе результатов теста "Открытое поле" была выявлена статистическая тенденция к увеличенному количеству стоек (табл. 2). По остальным показателям не было выявлено статистически значимых различий с контрольной группой: не наблюдалось существенных изменений двигательной активности, времени груминга и количества дефекаций. Таким образом, можно сделать вывод, что неонатальное введение пептида НАЛЭ способно нормализовать ранние и отдаленные поведенческие отклонения у крыс, перенесших ВУГ и ранний постнатальный стресс.

Нейропротективный эффект пептида НАЛЭ может быть обусловлен содержанием в его структуре аминокислоты аргинин [14, 11]. Для проверки роли аминокислоты аргинин в эффектах неопиатного аналога лей-энкефалина, мы провели исследование оригинального пептида G, отличающегося от НАЛЭ заменой С-концевой аминокислоты аргинин на глицин. При анализе поведенческих тестов, проведенных на 7 сутки жизни у крыс, получавших инъекции пептида G после ВУГ (группа "ВУГ+G"), мы наблюдали отсутствие достоверного отличия времени разворота в тесте "Отрицательный геотропизм" от контрольного показателя (Ме_{контроль}=7,7 [4,8; 13,03]; Me_ВУГ+G= 11,7 [6,94; 22,7]; р>0,05). Вместе с тем, следует отметить, что в этой группе показатель времени поворота был на 51 % выше контроля и на 25,4 % выше аналогичного показателя группы "ВУГ+НАЛЭ". При анализе поведенческих тестов у 30-суточных животных группы "ВУГ+G" мы получили следующие результаты. В тесте "Приподнятый крестообразный лабиринт" существенно увеличивалось время нахождения в центре лабиринта - в 6,4 раза по сравнению с контрольной группой и в 3,2 раза по сравнению с группой ВУГ (табл. 1). Также достоверно (в 2 раза) увеличивалось количество входов в открытые рукава по сравнению с контрольной группой. В тесте "Открытое поле" у животных этой группы мы наблюдали достоверное увеличение количества пересеченных секторов, количество грумингов и принюхиваний (табл. 2). Отмечалась статистическая тенденция к увеличению количества стоек и посещений центральных секторов. Эти изменения можно расценивать как проявление "двигательной расторможенности". В целом, можно отметить, что замена С-концевой аминокислоты в структуре неопиатного аналога лей-энкефалина существенно модифицирует влияние неонатального введения пептида на поведенческие реакции животных.

Чтобы проверить гипотезу о вовлечении системы оксида азота в реализацию эффектов пептида НАЛЭ, мы включили в исследование группу животных, которым, после воздействия ВУГ, вместе с пептидом НАЛЭ вводили неселективный ингибитор NO-синтетазы L-NAME (группа "ВУГ+НАЛЭ+L-NAME"). У 7-суточных животных этой экспериментальной серии мы наблюдали достоверное увеличение времени поворота в тесте "Отрицательный геотропизм" (Ме_{контроль}=7,7 [4,8; 13,03]; Me_{ВУГ+НАЛЭ+L-NAME}=13,7 [10,16; 20,66]; р<0,05). Следует отметить, что показатель группы "ВУГ+НАЛЭ+L-NAME" также достоверно превышал аналогичный параметр групп "ЭБВ" (MeЭБВ=10,7 [7,43; 14,53]; Me_{ВУГ+НАЛЭ+L-NAME}=13,7 [10,16; 20,66]; р<0,05) и "ВУГ+НАЛЭ" (MeВУГ+НАЛЭ=9,3 [7,92; 13;84]; Me_{ВУГ+НАЛЭ+L-NAME}= 13,7 [10,16; 20,66]; р<0,05). У 30-суточных животных группы "ВУГ+НАЛЭ+L-NAME" в тесте "Приподнятый крестообразный лабиринт" выявлено достоверное увеличение общей двигательной активности, по сравнению с контролем (таблица 1). В тесте "Открытое поле" зарегистрировано достоверное возрастание (почти в два раза) количества посещений периферических секторов и общего количества пересеченных секторов (таблица 2). Таким образом, блокада оксида азота препятствует реализации как ранних (у 7-суточных животных), так и отдаленных (у 30-суточных животных) нейропротективных эффектов пептида НАЛЭ.

Результаты проведенного исследования свидетельствуют о выраженном нейропротективном влиянии неонатального введения пептида НАЛЭ у животных, подвергнутых неблагоприятному воздействиям в ранние периоды онтогенеза. В механизмах реализации эффектов пептида НАЛЭ значимую роль играет С-концевая аминокислота аргинин, поскольку модифицированный неопиатный аналог лей-энкефалина с заменой С-концевой аминокислоты аргинин на аминокислоту глицин давал значительно менее выраженный корректирующий эффект. Полное нивелирование позитивных эффектов пептида НАЛЭ сопутствующей блокадой NO-синтазы свидетельствует о значимой роли системы оксида азота в нейропротективном действии пептида.

Список источников

1. 1. Гостюхина А.А., Cамощина Т.А., Светлик М.В. и др. Поведенческая активность крыс в "открытом поле" после световой или темновой деприваций и физического переутомления. Бюллетень сибирской медицины. - 2016. - № 15 (3). - С. 16-23.
2. 2. Григорьев Н.Р., Баталова Т.А., Кириченко Е.Ф., Сергиевич А.А., Чербикова Г.Е. Типологические особенности поведения крыс // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. - 2007. - Т. 93, № 8. - С. 817-826.
3. 3. Зарубина И.В. Современные представления о патогенезе гипоксии и ее фармакологической коррекции // Обзоры по клин. фармакол. и лек. терапии. - 2011. - Т. 9, № 3. - С. 31-48.
4. 4. Карасёв А.В., Лебедев С.В., Гарац Т.В., Шаримбжанова А.В., Макаров А.М., Володин Н.Н., Чехонин В.П. Мониторинг двигательных нарушений при тяжелом гипоксически-ишемическом повреждении головного мозга крыс 7-дневного возраста // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2010. - Т. 149, № 6. - С. 614-618.
5. 5. Мамылина Н.В. Анализ поведенческой активности экспериментальных животных, перенесших эмоционально-болевой стресс // Современные проблемы науки и образования. - 2011. - № 5.
6. 6. Маткеева А.Т., Ашералиев М.Е., Маймерова Г.Ш. Факторы риска у детей с СДВГ в сочетании с соматической патологией // Бюллетень науки и практики. - 2020. - № 5. - С. 120-127. DOI: 10.33619/2414-2948/54/15.
7. 7. Сазонова Е.Н., Симанкова А.А., Лебедько О.А., Тимошин С.С. Влияние антенатальной гипоксии на поведенческие реакции половозрелых белых крыс // Дальневосточный медицинский журнал. - 2011. - № 4. - С. 89-92.
8. 8. Симанкова А.А. Влияние антенатальной гипоксии на некоторые структурно-функциональные показатели головного мозга новорожденных белых крыс // Успехи науки и естествознания. - 2011. - № 8. - С. 132-133.
9. 9. Allen K.M., Fung S.J., Shannon Weickert C. Cell proliferation is reduced in the hippocampus in schizophrenia // Australian & New Zealand Journal of Psychiatry. - 2016. - Vol. 50 (5). - P. 473-480. DOI: 10.1177/0004867415589793.
10. 10. Cao B., Passos I.C., Mwangi B., Bauer I.E., Zunta-Soares G.B., Kapczinski F., Soares J.C. Hippocampal volume and verbal memory performance in late-stage bipolar disorder // Journal of Psychiatric esearch. - 2016. - Vol. 73. - P. 102-107. DOI: 10.1016/j.jpsychires.2015.12.012.
11. 11. Edwards A.B., Anderton R.S., Knuckey N. W., Meloni B.P. Perinatal Hypoxic-Ischemic Encephalopathy and Neuroprotective Peptide Therapies: A Case for Cationic Arginine-Rich Peptides (CARPs) // Brain Sciences. - 2018 Aug. - Vol. 8 (8). - P. 147. DOI: 10.3390/brainsci8080147.
12. 12. Frontiñ án-Rubio J., Sancho-Bielsa F.J., Peinado J.R., LaFerla F.M., Giménez-Llort L., Durán-Prado M., Alcain FJ. Sex-dependent co-occurrence of hypoxia and β-amyloid plaques in hippocampus and entorhinal cortex is reversed by long-term treatment with ubiquinol and ascorbic acid in the 3 × Tg-AD mouse model of Alzheimer's disease // Molecular and Cell Neuroscience. - 2018 Oct. - Vol. 92. - P. 67-81. DOI: 10.1016/j.mcn.2018.06.005.
13. 13. Koneru A., Satyanarayana S., Rizwan Sh. Endogenous Opioids: Their Physiological Role and Receptors // Global Journal of Pharmacology. - 2009. - Vol 3 (3). - P. 149-153.
14. 14. Meloni B.P., Milani D., Edwards A.B., et al. Neuroprotective peptides fused to arginine-rich cell penetrating peptides: Neuroprotective mechanism likely mediated by peptide endocytic properties // Pharmacology and Therapeutics. - 2015 Sep. - Vol. 153. - P. 36-54. DOI: 10.1016/j.pharmthera.2015.06.002.
15. 15. Wang B., Zeng H., Liu J., Sun M. Effects of Prenatal Hypoxia on Nervous System Development and Related Diseases // Frontiers in Neuroscience. - 2021 Oct. - Vol. 15. - Art. 755554. DOI: 10.3389/fnins.2021.75555.