2024 год № 2

Аннотация:

Ключевые слова:

Abstract:

Key words:

Введение

Этанол и его метаболиты (ацетальдегид, уксусная кислота, свободные радикалы и др.) оказывают повреждающее действие на мембраны клеток головного мозга, вызывая торможение выработки нуклеиновых кислот и белков и понижая функциональную активность нейромедиаторных систем, что приводит к развитию патологий нервной системы [1, 2, 3]. Лечение неврологических нарушений требует длительного времени и продолжительных курсов лекарственной терапии, во время которой могут развиться токсические реакции и побочные эффекты [18]. В связи с чем, рациональным выбором является использование лекарственных средств растительного происхождения в комплексном лечении заболеваний нервной системы, длительный курс приема которых в меньшей степени способствует развитию побочных эффектов, а благодаря широкому спектру метаболитов, оказывает полимодальное действие на организм [12, 18].

К перспективным нейропротекторам относятся растения семейства Asteraceae - Leuzea uniflora (L.) Holub и Klasea centauroides L., содержащие в своём составе экдистероиды, флавоноиды, фенилпропаноиды и другие биологически активные вещества [6]. Эти растения имеют значительную сырьевую базу, произрастают не только в Сибири и на Дальнем Востоке России, но также в других странах, таких как Китай, Корея и Северная Монголия [11] и применяются в традиционной медицине для улучшения физической и психической устойчивости организма [10].

В ранее проведенных экспериментах установлено, что экстракты сухие, полученные из надземной части L. uniflora и K. centauroides, увеличивают резистентность организма к физическим нагрузкам и гипоксии, понижают уровень тревожности и эмоциональности, стимулируют когнитивные функции и ориентировочно-исследовательскую активность у животных [8, 9], а также проявляют нейропротективное влияние в условиях гипоксии и ишемии головного мозга [4, 17].

Цель работы - оценить влияние экстрактов сухих Leuzea uniflora и Klasea centauroides на морфофункциональное состояние головного мозга белых крыс при длительной алкогольной интоксикации.

Материалы и методы

Исследования проводились в зимнее время года, на 60 белых крысах-самках Wistar массой 220-240 г. Животных содержали в одинаковых условиях, по 10 особей в клетке, со свободным доступом к воде и пище, соответственно с Правилами надлежащей лабораторной практики (GLP) и Постановлением Правительства РФ N855 от 13 июня 2020 г. Экспериментальную работу проводили согласно правилам, установленным в Европейской конвенции по защите позвоночных животных (Страсбург, 1986 г.).

В качестве объектов исследования выступали экстракты сухие, полученные из надземной части L. uniflora и K. centauroides. Количественную стандартизацию экстрактов сухих проводили с помощью метода высокоэффективной хроматографии с УФ детектированием с дальнейшим определением 20-гидроксиэкдизона. Содержание 20-гидроксиэкдизона составило не менее 3 % в экстракте сухом L. uniflora и не менее 2 % в экстракте сухом K. centauroides [16]. Принимая во внимание, что в ранее проведенных экспериментах нейропротективное влияние экстракты L. uniflora и K. centauroides оказывали в диапазоне доз 100-300 мг/кг, в данном исследовании была взята наименьшая терапевтически-эффективная доза - 100 мг/кг. В качестве препарата сравнения был выбран экстракт G. biloba (препарат сравнения Танакан, ПN011709/01, "Бофур Ипсен Индастри", Франция) в аналогичной дозе.

Перед исследованием животные, соответствующие критериям включения в эксперимент, были разделены на группы по принципу рандомизации - позитивный контроль, негативный контроль и три опытных, в каждой их групп было по 12 животных. В течение 6 недель, животным группы негативного контроля и всех опытных групп внутрижелудочно вводили этиловый спирт, разведенный до 40 % дистиллированной водой, в дозе 10 мл/кг. У животных группы позитивного контроля алкогольная интоксикация не моделировалась, они получали дистиллированную воду в объеме 10 мл/кг в течение эксперимента. Начиная с 3-й недели животные опытных групп I-III получали экстракты L. uniflora, K. centauroides и G. biloba соответственно. Водные растворы экстрактов в объеме 10 мл/кг вводились животным внутрижелудочно один раз в сутки не менее чем через час после 40 % раствора этанола [7]. Для определения уровня тревожности у животных использовали тест "открытое поле", а оценку мнестических функций проводили по методике "условная реакция пассивного избегания" (УРПИ). Тестирование в "открытом поле" проводили на 41 сутки эксперимента, выработку УРПИ и проверку через 1 час - на 42 сутки, проверку через 24 и 72 часа - на 43 и 45 сутки соответственно [7].

Материалом для морфологических исследований являлась кора больших полушарий головного мозга. Гистологические препараты были приготовлены по стандартной методике и окрашены по Нисслю крезилвиолетом [6]. Для того, чтобы оценить повреждение нейронов головного мозга, проводили морфометрический анализ на микроскопе "Axio LAB.A1" с цифровой камерой "Axio Cam ERc5s" с программным обеспечением для анализа изображений Axio Vision SE64 Rel.4.8.3 и ZEN2012. На 8 срезах подсчитывали не менее тысячи нейронов суммарно во II-V слоях при увеличении ×400, которые дифференцировали на нормохромные, гипохромные, гиперхромные (пикнотические) и "клетки-тени". Полученные результаты выражали в процентах от общего числа клеток.

Статистический анализ данных осуществлялся с помощью пакета программ Statistica for Windows 6.0. Предварительно проводили оценку анализируемых данных соответствию закону нормального распределения по критерию Шапиро-Уилка. Данные, не подчиняющиеся закону нормального распределения вероятностей, оценивали с помощью критерия Манна-Уитни; имеющих нормальное распределение - параметрического t-критерия Стьюдента. Для сравнения частоты выработки рефлекса между группами применяли критерий Фишера. Различия считались достоверными при достижении уровня значимости p≤0,05.

Результаты и обсуждение

В ходе эксперимента было установлено, что на фоне длительной алкогольной интоксикации у негативной контрольной группы животных повышалась "тревожность" и снижалась ориентировочно-исследовательская активность в "открытом поле". Так, на фоне увеличения числа актов груминга и дефекаций у животных негативной контрольной группы такие показатели, как количество вертикальных стоек без опоры и норковый рефлекс, снизились в среднем на 55 %, число периферических квадратов - на 39 % в сравнении с результатами животных позитивной контрольной группы (рис. 1).

Рис. 1. Поведенческие показатели животных в "открытом поле" на фоне длительной алкогольной интоксикации

Введение экстрактов L. uniflora и K. centauroides уменьшало у животных уровень тревоги и стимулировало исследовательскую активность. Так, данные горизонтальной активности у животных I и II опытных групп были выше в 1,6 и 1,4 раза соответственно, а количество вертикальных стоек без опоры - в 2,4 и 1,8 раза в отношении таковых у животных негативной контрольной группы. Исследуемые экстракты оказывали стимулирующее влияние на норковый рефлекс, увеличивая его на 36 %; данный показатель у крыс, получавших референтный препарат, статистически значимо не отличался от аналогичного в негативной контрольной группе. Число актов груминга у животных I и II опытных групп было сходным по значению с результатами негативной контрольной группы животных, тогда как в III опытной группе - снизился в 2,0 раза (рис. 1).

При проверке УРПИ выявлено, что алкогольная интоксикация негативно влияет на процесс первоначальной обработки и запоминания информации: условная реакция выработалась у 75 % животных в негативной контрольной группе (рис. 2), а латентный период во все сроки наблюдения у них был ниже результата позитивной контрольной группы животных (рис. 3). При этом в I и II опытных группах УРПИ сформировался у 100 % животных, а в III группе, получавшей препарат сравнения - у 90 % животных. Тестирование животных через 24 и 72 часа показало, что условный рефлекс в I опытной группе сохранился у 100 % животных, тогда как во II и III опытных группах данный показатель составил 80 %. Показатель латентного периода в I и II опытных группах превышал соответствующий у негативной контрольной группы животных в 1,3 раза на всех сроках проверки УРПИ (рис. 2).

Рис. 2. Показатели латентного периода в тесте "условный рефлекс пассивного избегания" в условиях длительной алкогольной интоксикации

Рис. 3. Количество животных с выработанным условным рефлексом пассивного избегания в условиях длительной алкогольной интоксикации

По данным морфологических исследований, при длительной интоксикации алкоголем, в коре больших полушарий возникали структурные изменения, сопровождающиеся увеличением числа резко гиперхромных нейронов в 5,5 раз, а также "клеток-теней" в 2,5 раза по сравнению с результатами животных позитивной контрольной группы (таблица). В последних, на фоне бледной гомогенной цитоплазмы не определялись контуры ядерных компонентов - оболочка, ядрышко и хроматин. Размер резко гиперхромных нейронов был уменьшен, а апикальный дендрит истончен и прослеживался на длительном расстоянии. Наиболее часто гиперхромные нейроны встречались в III и V слоях, а "клетки-тени" располагались диффузно во всех слоях коры больших полушарий (рис. 4).

Рис. 4. Кора больших полушарий белых крыс при длительной алкогольной интоксикации. Окраска крезилвиолетом по Нисслю. Увеличение ×200

Примечание. а - животное позитивной контрольной группы; b - животное негативной контрольной группы; c - животное, получавшее экстракт сухой L. uniflora; d - животное, получавшее экстракт сухой K. Centauroides.

На фоне введения исследуемых экстрактов в коре больших полушарий крыс структурные изменения были менее выражены в сравнении с данными негативной контрольной группы. У животных, которые получали экстракты K. centauroides и G. biloba, отмечалось снижение числа гиперхромных нейронов на 52-57 %, а "клеток-теней" на 16 и 44 % соответственно по сравнению с данными животных негативной контрольной группы. Применение экстракта L. uniflora способствовало более заметному уменьшению структурных изменений в нейронах: количество гиперхромных нейронов было ниже на 75 %, резко гипохромных - на 33 % и "клеток-теней" - на 54 %, чем в негативной контрольной группе животных. В результате снижения числа "клеток-теней" при малом увеличении микроскопа не наблюдалось "зоны опустошения". Среди нормохромных нейронов выявляли клетки с умеренным периферическим гиперхроматозом, что свидетельствовало об их функциональной активности (рис. 4c).

Снижение у животных опытных групп образования регрессивных форм нейронов свидетельствовало о повышении устойчивости ткани головного мозга к длительной алкогольной интоксикации на фоне применения экстрактов L. uniflora и K. centauroides.

Длительная алкогольная интоксикация влечет за собой выработку нейротоксичных веществ, снижение высвобождения ГАМК, нарушение процесса гликолиза, а также стимулирует образование активных форм кислорода (АФК) и развитие нейродегенеративных процессов в головном мозге [1, 2]. Выявленное в условиях длительной алкогольной интоксикации нейропротективное действие исследуемых экстрактов, предположительно, обусловлено действием биологически активных веществ, содержащихся в листьях растений L. uniflora и K. centauroides. Экдистероиды улучшают работу нейронов за счет индукции глутаматдекарбоскилазы, участвующей в биосинтезе ГАМК, а 20-гидроксиэкдизон, выявленный в наибольшем количестве среди экдистероидов в составе данных растений, снижает избыточный уровень стресс-медиаторов [15]. Вследствие этого нейропротективные свойства экстракта L. uniflora наиболее выражены за счет высокого содержания в составе экдистероидов в сравнении с экстрактом K. centauroides. Флавоноиды, входящие в состав исследуемых экстрактов, такие как лютеолин, кверцетин, апигенин, имеют способность тормозить патологические процессы в головном мозге, снижать выработку АФК и предупреждать развитие воспалительного процесса в нервной ткани [13]. Среди фенилпропаноидов, имеющихся в составе экстрактов L. uniflora и K. centauroides, наиболее значимое нейропротективное влияние оказывает 5-O-кофеилхинная кислота, так как обладает выраженными антиоксидантными и противовоспалительными свойствами, и предотвращает развитие сосудистых и нейродегенеративных заболеваний [14].

Выводы

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что экстракты сухие, полученные из листьев L. uniflora и K. centauroides при длительной алкогольной интоксикации проявляют нейропротективные свойства, предотвращая развитие структурных нарушений в коре головного мозга, тем самым снижая у животных тревожность и эмоциональность, усиливая ориентировочно-исследовательскую активность и нормализуя мнестические функции. Наиболее выраженное нейропротективное действие при длительной алкогольной интоксикации проявляет экстракт сухой L. uniflora.

Список источников

1. 1. Гриненко А.Я., Афанасьев В.В., Бабаханян Р.В., Бушуев Е.С., Дунаевский В.В., Заславский Г.И., Попов В.Л., Сафрай А.Е., Стяжкин В.Д. Хроническая алкогольная интоксикация. - СПб.: Издательство Р. Асланова "Юридический центр Пресс", 2007.
2. 2. Долго-Сабуров В.Б., Петров А.Н., Лисицкий Д.С., Беляев В.А. Центральные нейрохимические эффекты острого и хронического воздействия этанола. Механизмы толерантности и зависимости (обзор литературы) // Medline.ru. - 2011. - № 12 (2). - С. 1423-1436.
3. 3. Зиновьева О.Е., Ващенко Н.В., Мозговая О.Е., Янакаева Т.А., Емельянова А.Ю. Поражение нервной системы при алкогольной болезни // Неврология, нейропсихиатрия, психосоматика. - 2019. - № 11. - С. 83-88.
4. 4. Маркова К.В., Торопова А.А., Разуваева Я.Г., Оленников Д.Н. Исследование противоишемического действия экстрактов сухих Rhaponticum uniflorum и Serratula centauroides на модели билатеральной окклюзии сонных артерий // Acta Biomedica Scientifica. - 2022. - № 7 (1). - С. 28-36. doi.org/10.29413/ABS.2022-7.1.4.
5. 5. Микроскопическая техника: Руководство / Под ред. Д.С. Саркисова, Ю.Л. Перова. - М., 1996. - 544 с.
6. 6. Николаева И.Г., Цыбиктарова Л.П., Гармаева Л.Л., Николаева Г.Г., Оленников Д.Н., Матханов И.Э. Определение содержания экдистероидов в сырье Rhaponticum uniflorum и Serratula centauroides методом хроматоспектрофотометрии // Журнал аналитической химии. - 2017. - № 72 (8). - С. 733-741. doi.org/10.7868/S0044450217080047.
7. 7. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая / Под ред. А.Н. Миронова. - М.: Гриф и К, 2012.
8. 8. Свиридов И.В. Адаптогенные свойства экстракта сухого Serratula centauroides L. Автореф. дис…канд. мед. наук. - Улан-Удэ, 2016. - 22 с.
9. 9. Татаринова Н.К. Адаптогенные свойства экстрактов Fornicium uniflorum L. Автореф. дис…канд. мед. наук. - Улан-Удэ, 2017. - 20 с.
10. 10. Шантанова Л.Н., Дашиев Д.Б., Раднаева Д.Б., Петрова Т.Г. Адаптогены в тибетской медицине // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2008. - № 3. - 175 с.
11. 11. Шишмарев В.М., Шишмарева Т.М. Характеристика ценопопуляций Serratula centauroides (Compositae) в Забайкалье // Известия Иркутского государственного университета. - 2021. - № 36. - С. 16-23.
12. 12. Amirzargar N., Heidari-Soureshjani S., Yang Q., Abbaszadeh S., Khaksarian M. Neuroprotective effects of medicinal plants in cerebral hypoxia and anoxia: a systematic review // The Natural Products Journal. - 2020. - № 10 (5). - Р. 550-565. doi.org/10.2174/2210315509666190820103658.
13. 13. Hu J. Luo C.X., Chu W.H., Shan Y.A., Qian Z.M., Zhu G., Yu Y.B., Feng H. 20-Hydroxyecdysone protects against oxidative stress-induced neuronal injury by scavenging free radicals and modulating NF-kappa and JNK pathways // PLoS ONE. - 2012. - № 7: e50764.
14. 14. Lu H. Chlorogenic acid: A comprehensive review of the dietary sources, processing effects, bioavailability, beneficial properties, mechanisms of action, and future directions / H. Lu, Z. Tian, Y. Cui, Z. Liu, X. Ma // Comprehensive reviews in food science and food safety. - 2020. - Vol. 19, № 6. - Р. 3130-3158.
15. 15. Pang Q., Zhao Y., Chen X., Zhao K., Zhai Q., Tu F. Apigenin protects the brain against ischemia/reperfusion injury via Caveolin-1/VEGF in vitro and in vivo // Oxidative Medicine and Cellular Longevity. - 2018; 7017204.
16. 16. Shantanova L.N., Olennikov D.N., Matkhanov I.E., Gulyaev S.M., Toropova A.A., Nikolaeva I.G., Nikolaev S.M. Rhaponticum uniflorum and Serratula centauroides extracts attenuate emotional injury in acute and chronic emotional stress // Pharmaceuticals. - 2021. - № 14. - Р. 1186.
17. 17. Toropova A.A., Razuvaeva Y.G., Olennikov D.N., Markova K.V., Lemza S.V. Protective effects of Leuzea uniflora (Rhaponticum uniflorum) on the brain mitochondrial function in white rats at hypoxia/reoxygenation // Natural Product Research. - 2022. - № 36: 36495287. doi: 10.1080/14786419.2022.2155646.
18. 18. Uddin M.J., Zidorn C. Traditional Herbal Medicines Against CNS Disorders from Bangladesh // Natural Products and Bioprospecting. - 2020. - № 10. - Р. 377-410. doi.org/10.1007/s13659-020-00269-7.